邓 涛, 夏贤仁, 李先才, 吴 凯, 吴姝俊, 王全贞, 郭启超, 余森申*
(1.云南省烟草公司 曲靖市公司, 云南 曲靖 655000; 2.云南师范大学 能源与环境科学学院, 云南 昆明 650500; 3.云南五佳生物科技有限公司, 云南 昆明 650106)
【研究意义】烤烟是重要的经济作物,在国民经济中占有重要地位。我国烤烟产量约占全球总产量的一半,同时也面临着巨大的病虫害防控压力,常见的烟草病害如烟草黑胫病、根黑腐病、野火病、赤星病、青枯病和花叶病等在我国各大烟区均普遍存在,据统计,每年由于病害造成的损失在总产量的10%～15%[1-2]。目前,化学防治方法依然是最为普遍、有效、低成本、受限因素小的病害防治手段,但化学农药的大量使用带来了农残问题,影响烟叶品质及安全性,威胁人体健康,此外,长期大量使用化学农药促使病原菌、害虫等的抗药性增加,广谱性化学农药易对害虫天敌造成误杀,防效变得越来越差[3-4],同时伴随着一系列的环境污染问题。近年来,生产观念改变及科技投入提高,生物防治得到了前所未有的重视,其中,微生物源农药是生物制剂中的重要类型之一,利用微生物自身或产生的活性成分对害虫、病原菌等农业上有害的生物因素进行杀灭[5],具有安全、高效、对环境友好等作用。【前人研究进展】微生物菌剂兼具防病、促产、提质的优点。施河丽等[6]研究表明,微生物菌剂与黄腐酸协同处理的烤烟在移栽后120 d其青枯病发病率从81.11%降至41.11%,发病率和病情指数显著降低;同时改变了土壤细菌群落结构。邹朔飞等[7]通过平板对峙及田间防效试验筛选出郝氏链霉菌(Streptomyceshalstedii)作为防治烟草黑胫病的拮抗菌,其在田间对黑胫病的相对防效达75.30%,高于化学药剂甲霜·噁霉灵水剂。师超等[8]在利川烟区对比3种微生物菌剂对烟草黑胫病和青枯病的防治效果表明,认为荧光假单胞菌粉剂对烟草黑胫病防治效果显著,并具有明显的促产作用,产量、产值的增幅分别达到10.86%和10.06%。微生物菌剂也是改善由连作引起的土壤退化问题的重要途径,刘红杰等[9]研究表明,微生物菌剂(微生物复合肥、摩西球囊霉、幼套球囊霉及根内球囊霉)能显著影响土壤酶活性,进而影响各种代谢活动。【研究切入点】宣威烟区是全国烟叶产量最大的县级烟区,也面临着使用化学农药带来的一系列问题。目前,生物制剂在宣威烟区的研究应用较少,仅徐洪宇等[10]在宣威烟区对比了普通有机肥及其与枯草芽孢杆菌配施对土壤条件及烤烟产质量的影响,对指导烟叶生产的作用有限。【拟解决的关键问题】拟在宣威北部烟区现有化学药剂防治主要土传病害的现状条件下,通过对比分析枯草芽孢杆菌、木霉菌和苦参硫磺3种生物制剂对土壤理化性质、微生物多样性、烤烟农艺性状及烟叶品质的影响,明确最佳的绿色生物源农药及其使用方法,保障烟区的可持续发展。
1.1 试验地概况
试验于2021年在云南省宣威市宝山镇(104.466°E, 26.298°N)进行,平均海拔2 050.92 m,土壤类型为红壤,肥力中等。
1.2 试验材料
1.2.1 烤烟品种 供试烤烟为云烟100,种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供,由宣威市宝山烟叶站育苗。
1.2.2 菌剂 枯草芽孢杆菌(有效活菌100亿个/g)及木霉菌(有效活菌2亿个/g),均购自云南星耀生物制品有限公司;苦参硫磺(总有效成分含量13.7%),购自山东省成武县有机化工厂。
1.2.3 肥料 烟草专用复合肥(N∶P2O5∶K2O=14∶10∶24);商品有机肥(总养分≥5.0%,有机质≥60%),均购自云南云叶化肥股份有限公司;硝酸钾(N∶P2O5∶K2O=13.5∶0∶44.5),购自四川米高化肥有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计 采用随机区组试验设计,共设6个处理:CK,不施药(均用等量清水淋根);A,还苗期用枯草芽孢杆菌1 500 g/hm2稀释600倍喷施+淋根,14 d后施用第2次(药剂和用量与第1次相同,下同);B,还苗期用木霉菌1 500 g/hm2用量稀释600倍喷施+淋根,14 d后施用第2次;C,还苗期用13.7%苦参硫磺1 500 g/hm2稀释600倍喷施+淋根,14 d后施用第2次;AC,还苗期用13.7%苦参硫磺1 500 g/hm2稀释600倍喷施+淋根,14 d后用枯草芽孢杆菌1 500 g/hm2稀释600倍喷施+淋根;BC,还苗期用13.7%苦参硫磺1 500 g/hm2稀释600倍喷施+淋根,14 d后用木霉菌1 500 g/hm2稀释600倍喷施+淋根。每个处理3次重复,共计18个小区,小区面积67 m2,株行距为120 cm×55 cm。各处理烤烟统一于4月14日移栽。烟草专用复合肥和商品有机肥作为基肥,用量均为600 kg/hm2,烤烟移栽15 d后,用硝酸钾150 kg/hm2进行追肥。田间栽培管理措施按当地优质烟栽培技术要点进行,烟叶采收后分类装炉、统一烘烤。
1.3.2 指标测定
1) 植烟土壤理化性质。于烤烟生长成熟期采集土壤样品测定pH及有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷、速效钾含量,分别参照《土壤检测 第2部分:土壤pH的测定》(NY/T 1121.2—2006)、《土壤检测 第6部分:土壤有机质的测定》(NY/T 1121.6—2006)、《土壤检测 第24部分:土壤全氮的测定自动定氮仪法》(NY/T 1121.24—2012)、《土壤全磷测定法》(GB 9837—1988)、《土壤全钾测定法》(GB 9836—1988)、《森林土壤水解性氮的测定》(LY/T 1229—1999)、《土壤检测 第7部分:土壤有效磷的测定》(NY/T 1121.7—2014)、《土壤速效钾和缓效钾含量的测定》《NY/T889—2004》进行检测;通过环刀法测定土壤容重、比重和总孔隙度,胡敏酸、富里酸及富敏素的提取和分离参考《森林土壤腐殖质组成的测定》(LY/T 1238—1999)及文献[11]的方法进行。
2) 微生物多样性。参照卢慧等[12]的方法采用高通量测序技术对成熟期土壤微生物群落进行测序。
3) 烟草主要病害调查。参照《烟草病虫害分级及调查方法》(GB/T 23222—2008)分别调查并计算各试验区烟草黑胫病和根黑腐病的发病率及相对防效。
烟株发病率=病株数/调查总株数×100%
相对防效=(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100%
4) 田间农艺性状调查。参照《烟草农艺性状调查测量方法》(YC/T 142—2010),在成熟期测定各处理烟株的株高、叶长、叶宽、节距、茎围和有效叶数。
5) 烟叶的物理特性。参照《烟草及烟草制品 试样的制备和水分测定 烘箱法》(YC/T 31—1996)测定烟叶平衡含水率,烟叶抗张力、叶面密度和含梗率均参照文献[13]的方法进行测定。
6) 烟叶的常规化学成分。参照《烟草及烟草制品 水溶性糖的测定 连续流动法》(YC/T 159—2002)、《烟草及烟草制品 总植物碱的测定 连续流动法》(YC/T 160—2002)、《烟草及烟草制品 总氮的测定 连续流动法》(YC/T 161—2002)、《烟草及烟草制品 氯的测定 连续流动法》(YC/T 162—2011)、《烟草及烟草制品 钾的测定 火焰光度法》(YC/T 173—2003)对烟叶常规化学成分进行检测。参照文献[14]的方法进行优质烟叶评价。
1.4 数据统计与分析
采用SPSS 23.0和Excel 2010进行数据处理,采用Duncan法进行多重比较;烟叶常规化学成分采用模糊数学隶属函数的数据模型进行评价[15]。
2.1 各处理烤烟主要病害的发病率与防效
从表1看出,不同施药处理成熟期烤烟田间主要病害的发生情况存在差异。根黑腐病:各处理的发病率为1.76%～3.59%,相对防效为28.77%～65.08%,发病率和相对防效分别依次为A>B>C>AC>BC和BC>AC>C>B>A,各处理的发病率均较CK(5.04%)低,除A外其余处理均显著低于CK。黑胫病:各处理的发病率为2.25%～3.00%,相对防效为31.82%～48.86%,发病率和相对防效分别依次为A>C>B>BC>AC和AC>BC>B>C>A,各处理的发病率均较CK(4.40%)低,除A外其余处理均显著低于CK。总体看,单施枯草芽孢杆菌(A)时,烟草根黑腐病和黑胫病发病率均不同程度降低,但与CK均未达显著水平,其相对防效分别为28.77%和31.82%;单施木霉菌(B)和苦参硫磺(C)使得根黑腐病和黑胫病发病率均较CK显著降低,且其对根黑腐病的相对防效分别为53.57%和54.96%,对黑胫病的相对防效分别为46.82%和35.68%;苦参硫磺与木霉菌(BC)及苦参硫磺与枯草芽孢杆菌(AC)配施的防治效果最好,其根黑腐病和黑胫病发病率均显著降低,AC和BC对根黑腐病的相对防效分别为55.56%和65.08%,对黑胫病的相对防效分别为48.86%和47.05%,二者又以BC防效更佳。此外,各处理对根黑腐病的防效优于对黑胫病的防效。
表1 不同处理烤烟根黑腐病和黑胫病的发病率及相对防效
2.2 土壤特性
2.2.1 土壤养分 从表2看出,不同处理成熟期植烟土壤养分含量存在差异。试验地块土壤肥力整体较高,有机质含量为56.20～61.35 g/kg,B最高,AC最低;全氮含量为2.42～2.85 g/kg,CK最高,AC最低;全磷含量为1.82～2.46 g/kg,B最高,C最低;全钾含量为6.89～7.85 g/kg,CK最高,AC最低;水解性氮含量为177.74～219.58 mg/kg,A最高,AC最低;有效磷含量为49.29～65.90 mg/kg,B最高,BC最低;速效钾含量为412.27～790.73 mg/kg,B最高,AC最低。AC土壤速效钾含量显著低于A和B,其余土壤养分各成分不同处理间无显著差异。
表2 不同处理植烟土壤的养分含量
2.2.2 土壤理化特性 从表3看出,施用不同生物菌剂对土壤物理特性影响较小,各处理间的物理特性均无显著差异。各处理的土壤容重为0.95～0.97 g/cm3,A、B与CK最大,其余处理较CK(0.97 g/cm3)低;比重为2.26～2.43 g/cm3,除B外其余处理均高于CK(2.30 g/cm3);孔隙度为56.80%～60.83%,除B外其余处理均高于CK(57.44%);胡敏酸碳含量为2.73～3.07 g/kg,除AC外其余处理均高于CK(2.75 g/kg);富里酸碳含量为4.97～5.55 g/kg,各处理均低于CK(5.98 g/kg);富敏素碳含量为24.90～27.12 g/kg,各处理均高于CK(24.87 g/kg)。综上看,单施苦参硫磺(C)及苦参硫磺分别配施枯草芽孢杆菌(AC)和木霉菌(BC)可使土壤容重呈降低趋势,孔隙度呈上升趋势。
表3 不同处理植烟土壤的理化特性
2.2.3 土壤微生物多样性 Shannon指数可用于表征群落的多样性,值越大表明群落的多样性越高。由图1看出,不同处理土壤细菌和真菌的多样性存在差异。细菌:土壤细菌多样性指数为8.06～8.60,依次为AC>C>BC>B>CK>A,各处理间无显著差异,除A稍低于CK外,其余处理均高于CK。真菌:土壤真菌多样性指数为6.80～7.59,依次为BC>C>B>AC>CK>A,其中,BC(7.59)显著高于CK(6.86);C(7.54)与CK差异不显著,B(7.34)显著高于CK;其余处理间无显著差异。
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
2.3 不同处理烤烟的产质量
2.3.1 农艺性状 由表4可知,不同处理烤烟成熟期的农艺性状存在差异。株高:各处理为105.6～128.0 cm,依次为AC>C>BC>B>A>CK,C、AC和BC显著高于CK,与其余处理无显著差异。叶面积:各处理为0.153～0.185 m2,依次为B>C>BC>AC>A>CK,B、C、AC和BC显著高于CK,与A无显著差异,其余处理间差异不显著。各处理有效叶片数为17.6～19.4片,茎围为9.488～10.179 cm,2个指标各处理间及其与CK均无显著差异。节距:各处理为6.780～7.212 cm,依次为AC>B>BC>A>C>CK,B和AC显著高于CK,与其余处理间无显著差异。整体看,AC、BC和B烟株田间长势表现较好,CK较差。
表4 不同处理烤烟成熟期的农艺性状
2.3.2 烟叶物理特性 从表5看出,不同处理烤后烟叶物理特性存在差异。
表5 不同处理各部位烟叶的物理特性
1) 中部叶(C3F)。各处理叶面密度为45.23～67.65 g/cm2,依次为C>BC>B>AC>CK>A,除A外其余处理均高于CK;抗张力为1.53～2.40 N,依次为BC>A>AC>C>B>CK,各处理均高于CK;平衡含水率为16.35%～17.50%,依次为AC>B>CK>A>BC>C,除AC和B外其余处理均低于CK;含梗率为28.38%～35.81%,依次为A>B>AC>CK>C>BC,除C和BC外其余处理均高于CK;物理特性总分为0.74～0.88分,依次为C>BC>B>AC>CK>A,除A外其余处理均高于CK,C最高,BC其次,原因在于2个处理的叶面密度相对较高,含梗率较低,而A较低则原因在于其叶面密度最低,含梗率最高。
2) 上部叶(B2F)。各处理叶面密度为65.71～101.06 g/cm2,依次为BC>A>C>CK>AC>B,除AC和B外其余处理均高于CK;抗张力为2.11～3.44 N,依次为B>A>BC>C=AC>CK,各处理均高于CK;平衡含水率为14.87%～16.47%,依次为B>AC>A>C>BC>CK,各处理均高于CK;含梗率为22.22%～29.39%,依次为B>CK>C>A>AC>BC,除B外其余处理均低于CK;物理特性总分为0.78～0.95分,依次为AC>CK=C=BC>A>B,除AC高于CK,C和BC与CK相等外其余处理均低于CK,AC最高,原因在于叶面密度和含梗率均较优,符合优质烟叶标准,CK、C及BC次之,3个处理叶面密度相对偏高,但其含梗率较低,B总分最低,原因在于其含梗率偏高,叶面密度较低。综合中部叶和上部叶来看,AC、BC烤烟物理特性表现较好。
2.3.3 烟叶的化学成分 从表6看出,不同处理烤后烟叶化学成分存在差异。
表6 不同处理各部位烟叶的化学成分
1) 中部叶(C3F)。各处理总糖含量为25.16%～39.08%,CK最高;还原糖含量为19.78%～28.03%,除AC外其余处理均低于CK(28.02%);总氮含量为1.82%～2.06%,CK最低;总植物碱含量为1.31%～1.64%,除B外其余处理均高于CK(1.59%);钾含量为1.02%～1.86%,CK最高;氯含量为0.44%～1.35%,除AC外其余处理均高于CK(0.77%);糖碱比为17.46～26.65,除AC外其余处理均低于CK(24.61);氮碱比为1.14～1.49,CK最低;钾氯比为1.33～2.31,CK最高;综合总分为0.34～0.49分,依次为CK>A>B>C>BC>AC;除A的总糖和还原糖含量接近优质烟叶标准[14]外,其余处理均偏高,导致糖碱比偏高,且各处理总植物碱含量略低,氮碱比偏高,氯离子含量整体偏高,钾氯比偏低,AC钾离子含量偏低且其综合得分最低,其次为BC。
2) 上部叶(B2F)。各处理总糖含量为19.43%～31.46%,除B和BC外其余处理均高于CK(29.53%);还原糖含量为11.42%～20.35%,除A和C外其余处理均低于CK(19.00%);总氮含量为2.04%～3.65%, CK最低;总植物碱含量为2.92%～3.79%,除BC外其余处理均低于CK(3.58%);钾含量为1.55%～2.08%,除BC和C外其余处理均低于CK(1.96%);氯含量为0.31%～0.79%,除C外其余处理均高于CK(0.44%);糖碱比为6.59～10.36,除B和BC外其余处理均高于CK(8.26);氮碱比为0.57～1.25,CK最低;钾氯比为1.95～6.69,除C外其余处理均低于CK(4.50);综合总分为0.54～0.72分,依次为A=C>AC>CK>BC>B,除A、C和AC外其余处理均低于CK;B综合总分最低,原因在于其还原糖含量偏低,总植物碱含量偏高,A和C除总糖含量偏高,其余指标均较好,总分最高,其次为AC,CK略低于AC。综合平均各处理中部叶和上部叶的总分看出,A(0.60分)综合总分较高,CK和C(0.59分)次之,AC(0.52分)、BC(0.51分)和B(0.50分)较低。
大田病害调查结果显示,枯草芽孢杆菌、木霉菌和苦参硫磺3种生物菌剂对烟草黑胫病和根黑腐均有一定的防治效果。木霉菌是一种高效广谱生防因子,广泛存在于土壤、空气和植物表面等生态环境,其防病机制包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导植物抗性作用等多种[16-17]。大量研究表明,木霉菌对烟草黑胫病和根黑腐病等土传病害具有明显抑制效果。李小杰等[18]从烟株根际土壤中筛选出3株对烟草疫霉菌具有较强抑制作用的木霉属生防菌,其产生的代谢产物对疫霉菌有一定程度的灭杀作用。刘利佳等[19]研究表明,接种木霉菌前后,存在大量差异代谢产物,对烟草疫霉菌的抗病响应在代谢水平发生变化,导致烟株对烟草疫霉菌的抗性增强。陈小均等[20]研究植烟土壤中的优势微生物种群与木霉菌之间的相互作用发现,木霉菌对多种优势真菌均表现出较好的抑制作用,表明木霉菌是多种烟草真菌病害的潜在拮抗菌。优势放线菌群落对木霉菌具有抑制作用,但对抑制土壤病原茄病镰刀菌又具有协同作用,优势细菌能够促进木霉菌产孢,利于其在土壤中定植,可见木霉菌与土壤微生物的关系是复杂多样。在本研究中,无论是单施还是与苦参硫磺配合施用,木霉菌均表现出良好的生防效果,并使得土壤真菌多样性显著提高,与李小杰等[18-20]的研究结论一致。苦参硫磺是由苦参碱改进而来,主要用于病毒病的防治,目前并无此类生物菌剂的相关研究报道。本研究发现,苦参硫磺与木霉菌或枯草芽孢杆菌配合使用对烟草黑胫病和根黑腐的防治效果最佳。
枯草芽孢杆菌菌剂是当前市面上应用最为广泛的生物菌剂之一,其有效菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的嗜温性好氧革兰氏阳性杆状细菌,通过定殖至植物根际、体表或体内,同病原菌形成竞争关系,其分泌的代谢产物对一些病原菌具有抑制作用,还可诱导植物防御系统抵御病原菌入侵,从而达到生防的目的[21]。韩腾等[22]研究表明,枯草芽孢杆菌粉剂灌根后,烤烟根际微生物群落发生变化,细菌多样性和丰富度显著提高。张成省等[23]从烟草叶面生境分离鉴定了一株枯草芽孢杆菌,其发酵产物具有较广的抗菌谱,对烟草常见病害如赤星病、炭疽病、根黑腐病、黑胫病及青枯病等病原菌均具有不同程度的抑制作用,且具有较强的热稳定性,对烟草普通花叶病毒(TMV)具有较强的钝化作用,同时可促进烟叶内多种酶活性的提高[24]。任鹏举等[25]研究认为,枯草芽孢杆菌产生的脂肽化合物表面活性素诱导了烟草防卫相关基因的表达以抵御TMV侵染。在本研究中,单施枯草芽孢杆菌对根黑腐病和黑胫病的防治效果未达预期,这也反映了生物菌剂在病害防治方面的一大问题,即菌剂在根际的定植受环境因素的影响较大,当与苦参硫磺配合使用后,防效显著提高,根黑腐病和黑胫病发病率显著降低,微生物多样性也有一定程度的提高,侧面反映了苦参硫磺改善土壤微环境的潜力。当前,由于生产成本、土壤微环境的复杂性等多种原因,各大烟区病害防治仍以化学农药为主,然后辅以生物农药。随着现代生物技术的广泛应用,基因组学和蛋白组学的蓬勃发展,绿色、安全的生物源农药具有广阔的应用前景。
苦参硫磺与木霉菌或枯草芽孢杆菌配合施用均对烟草黑胫病和根黑腐病具有良好的防治效果,烟草农艺性状表现较优,并改善了烟叶物理特性。单施木霉菌或苦参硫磺与木霉菌配施使土壤真菌群落多样性显著提高,但对烟叶化学成分的改善不理想。推荐用药方案:还苗期施用苦参硫磺(按1 500 g/hm2用量稀释600倍喷施+淋根),14 d后,施用木霉菌或枯草芽孢杆菌(按1 500 g/hm2用量稀释600倍喷施+淋根)。
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