李肖 陈永成 黄嵘峥 许平珠 张凡凡 马春晖
doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.03.010
摘 要：【目的】研究向日葵副产物中优势乳酸菌和纤维素分解菌的生理生化特征，为向日葵副产物发酵饲料提供基础。
【方法】对向日葵副产物表面附着优势乳酸菌及纤维素分解菌进行分离、提取鉴定，并分析优势菌种生理生化特征。
【结果】分离出3株乳酸菌和4株纤维素分解菌。得到3株乳酸菌均为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）。4株纤维素分解菌中，菌株Z2和Z13为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），X14为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），X4与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。3株乳酸菌在4、10、30和45℃及3%和6.5%的NaCl条件下生长良好，在pH 3.5～9可生长，在pH 3环境下不生长；
4株纤维素分解菌中透明圈直径（D）/菌落直径（d）比值和酶活性按大小排序均为解淀粉芽孢杆菌>贝莱斯芽孢杆菌>阿氏芽孢杆菌。
【结论】蒙氏肠球菌具有较强耐盐能力且温度适应范围广，但其产酸能力明显弱于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；
4株纤维素分解菌在CMC糖化酶活力、滤纸酶活性及向日葵副产物的实际失重率中，接种解淀粉芽孢杆菌效果最优。
关键词：向日葵副产物；
乳酸菌；
纤维素分解菌；
分离；
鉴定；
酶活性
中图分类号：S188 文献标志码：A 文章编号：1001-4330（2024）03-0607-08
收稿日期（Received）：
2023-08-05
基金项目：
农业农村部：国家现代农业产业技术体系项目（CARS）；
新疆维吾尔自治区优质饲草产业技术体系项目（2022XJSC-Z-02）
作者简介：
李肖（1998-），男，新疆伊犁人，硕士研究生，研究方向为饲草加工与生产，（E-mail）744364871@qq.com
通信作者：
张凡凡（1989-），男，新疆乌鲁木齐人，副教授，博士，硕士生导师，研究方向为饲草加工与生产，（E-mail）zhangfanfan@shzu.edu.cn
马春晖（1966-），男，新疆哈密人，教授，博士，硕士生/博士生导师，研究方向为饲草加工与生产，（E-mail）chunhuima@126.com
0 引 言
【研究意义】向日葵（Helianthus annuus）为菊科向日葵属的一年生经济作物，抗逆性强［1］。向日葵除籽实外剩余的副产物（葵秆、葵叶和葵盘）营养价值丰富［2］，若合理利用可作为反刍动物的饲料来源［3］，能够在一定程度上缓解局部饲草短缺压力。【前人研究进展】原料发酵过程中除底物有充足的碳源和氮源外，有益乳酸菌的数量是调控青贮的关键［4，5］；
当发酵原料表面附着乳酸菌低于105 cfu/g FW时，需要外源添加乳酸菌制剂来确保发酵品质。在实际生产过程中采取的手段主要为同、异质型乳酸菌联合接种，以最大程度减少发酵损失，提高青贮饲料有氧稳定性、减少二次发酵［6-7］。此外，纤维素的降解也是调控秸秆类原料发酵的主要问题，通过纤维素的降解不仅能够为发酵底物提供更为充足的碳源，且能夠改善饲料品质，促进家畜的利用效率［8］。当前降解纤维素的方法有物理法、化学法和生物法等。其中物理法和化学法［9］在降解纤维素时不仅会造成环境污染且成本较高，而生物法降解纤维素的过程温和无污染且成本较低。在实际生产中多采用外源添加纤维素酶降解青贮原料中的木质纤维素，然而纤维素酶成本较高不能大规模用于生产；
可通过添加纤维素分解菌来替换纤维素酶以降低成本［10］。当前，在自然界分离出的纤维素分解菌（细菌、真菌和放线菌等）多达200余种［11］，其中真菌如木霉属（Trichoderma sp）、青霉属（Penicillium sp）和曲霉属（Aspergillus sp）等多为耐酸菌，分泌胞外酶，但在缺氧的环境下酶活性会降低［10］，细菌多产胞内酶，抗逆性强且繁殖速度快［12］，而放线菌在繁殖速度和降解纤维能力上均弱于细菌和真菌，但有着更强的适应性［13］。【本研究切入点】近年来，对不同植物中的纤维素分解菌和优势乳酸菌进行筛选，其中不乏筛选出一些优质乳酸菌和纤维素分解菌［14-18］。当前对向日葵副产物中优势乳酸菌及纤维素分解菌的筛选未见相关报道。且向日葵副产物中纤维含量较高，是否附着纤维素分解菌目前尚不明确。需研究向日葵副产物中优势乳酸菌及分离鉴定其纤维素分解菌。有必要研究向日葵副产物中优势乳酸菌和纤维素分解菌的生理生化特征。【拟解决的关键问题】分离鉴定向日葵副产物植物表面的附生优势乳酸菌及其纤维素分解菌，筛选出向日葵青贮所用的优质乳酸菌和高产纤维素酶的纤维素分解菌菌株，为秸秆类青贮原料的菌剂研发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
所用向日葵副产物原料取自新疆阿勒泰地区哈巴河县（48°4′50.77″N，86°23′58.77″E，海拔530 m）。待向日葵成熟收取籽实（成熟期）后，于2021年9月1日收割其副产物（葵秆、葵盘和葵叶），并短切至1～2 cm备用。
1.2 方 法
1.2.1 乳酸菌的分离鉴定
乳酸菌的分离、纯化、生理生化鉴定：生长速率和产酸速率的测定参照张玉琳等［6］方法；
乳酸菌对碳源的利用测定参照凌代文［19］方法。3株菌株为乳酸球菌，测定的结果与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，Gen bank No.MZ008357）进行对比（命名为LP1）。
乳酸菌菌种分子生物鉴定：将纯化后的乳酸菌培养液按试剂盒说明提取各菌株DNA，DNA提取试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供。PCR扩增采用细菌通用引物
FA-27F：5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
RA-1495R：5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGGTACCTTGTTACGA-3′。
反应体系为（50 μL）：DNA模板5 μL，引物27F和1 495R（10 μmol/L）各1 μL，2×MasterMix25 μL，ddH2O补足至50 μL。反应程序为：95℃10 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃45 s，30个循环。将PCR扩增产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.2 纤维素分解菌的筛选鉴定
1.2.2.1 菌种分子鉴定
准确称取10 g样品，加入90 mL灭菌水后震荡30 min（37℃）得到菌悬液（1∶10）。将菌悬液梯度稀释后涂布羧甲基纤维素钠（CMC-Na）琼脂平板培养，将形态和大小不同的菌落划线纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序（所需引物为细菌通用引物，同乳酸菌菌种分子生物鉴定）。
1.2.2.2 纤维素分解菌菌株酶活力
将纤维素分解菌菌种接种至PDA液体培养中扩繁后涂布于羧甲基纤维素钠（CMC-Na）琼脂平板，倒置培养3～5 d（28℃）后划线纯化，再点接于CMC-Na琼脂平板倒置培养5 d（28℃），用1%刚果红染液染色后再用NaCl（1 mol/L）溶液去色，测量透明圈直径和菌落直径并计算其比值（D/d）［20］，同时连续测定5 d滤纸酶（FPA）和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）活性［21］。
1.2.2.3 纤维素分解菌菌种降解秸秆试验
将纤维素分解菌菌种接种于PDA液体培养基中扩繁（28℃培养3 d），再分别接种于以向日葵副产物为唯一碳源的液体发酵培养基中，接种量为10%，每过5 d测定向日葵副产物（纤维）失重率，观察25 d。纤维测定采用范式（Van Soest）洗涤法［22］，秸秆失重率%=（初始重量-接种菌种后重量）/初始重量×100%。
1.3 数据处理
采用Excel2020对所有试验数据进行整理，采用Origin2021软件绘图，在GenBank中对16SrDNA序列进行比对，用MEGA8.0中的ClustalW对最近类群的序列进行多重比较分析，通过该软件的邻近法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，确定各菌株分类地位［23］。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌菌株的生理生化特性
研究表明，3株菌株的革兰氏染色结果均为阳性，触酶试验为阴性。且所有菌株发酵葡萄糖产酸不产气，为同型发酵乳酸菌。除X1菌株在4℃环境表现为弱生长外，其他菌株均能正常生长。此外，所有菌株均能在10、30和45℃及3%NaCl和6.5% NaCl正常生长。所有菌株均能在pH 4～9生长，在pH 3.5呈弱生长，而pH 3明显抑制了菌株的生长。所有菌株对鼠李糖和蜜尔糖利用交弱，对松三糖不能利用，其余糖、醇均可利用，菌株LP1为植物乳杆菌L.plantarum。表1
2.2 乳酸菌和纤维素分解菌菌株的基因序列
研究表明，3株乳酸菌与标准菌株的序列相似性均超过99.89%，将每种菌各选部分参考菌株构建系统进化树，与蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）的进化亲缘度均为100%。3株乳酸菌株均为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）。菌株X12、X13、Z5在Genbank中的登录号为MZ008631、OL98461、OM102992。表2～3
4株纤维素分解菌与标准菌株的序列相似性均超过了99.89%，Z2和Z13与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的进化亲缘度为100%，X14与阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）的进化亲缘度为100%，X4与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的进化亲缘度为100%。Z2和Z13为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），X14为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），X4与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。图1
2.3 乳酸菌菌株的产酸速率及生长特性
研究表明，3株乳酸菌株均为蒙氏肠球菌。因此，随机选择3株乳酸菌株测定其产酸速率及生长特性，并以植物乳杆菌（LP1）进行对比。蒙氏肠球菌在0～10 h产酸速率较快，在10～24 h产酸速率逐漸变慢，植物乳杆菌的产酸速率在0～8 h较慢，8～14 h迅速下降，14 h后逐渐平缓，且植物乳杆菌的产酸速率在0～24 h均高于菌株X6、X7和X9。在培养4 h后蒙氏肠球菌进入对数生长期，14 h后进入稳定期，且在24 h内未出现停滞期，植物乳杆菌在0～8 h生长速率低于菌株X6、X7和X9，在18～24 h逐渐超越。图2
2.4 纤维素分解菌降解秸秆效果
研究表明，解淀粉芽孢杆菌（X4）透明圈直径和菌落直径及其比值（D/d）显著大于阿氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌（P<0.05），阿氏芽孢杆菌显著低于Z2、贝莱斯芽孢杆菌（P<0.05）。表3
随着时间的上升，4株菌株的CMC糖化酶活和滤纸酶活性随着培养时间的增加呈现先上升后降低的趋势，并在72 h左右酶活力达到峰值。其中菌株解淀粉芽孢杆菌的酶活性最高。
向日葵副產物失重率随着时间的增加而上升，菌种解淀粉芽孢杆菌降解向日葵副产物效果最优，阿氏芽孢杆菌最差。图3
3 讨 论
3.1 向日葵副产物中乳酸菌生理生化特征
试验从向日葵副产物中筛选出的3株乳酸菌种均为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）。研究中，蒙氏肠球菌能够利用除松三糖以外的糖，其中对鼠李糖和蜜二糖利用能力较弱，这与诸多研究结果一致［24-25］。优质乳酸菌应具有较高的产酸
及耐酸能力，并且竞争力强，生长旺盛。此外，蒙氏肠球菌能在4～45℃的环境下生长，且对高浓度的NaCl存在一定的耐受性，但在pH 3的环境
下很难生长。部分同质乳酸菌肠球菌（Enterococcus spp.）、片球菌（Pediococcus spp.）等在青贮发酵前期生长迅速，产酸较快，实际生产中往往与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）复合添加改善青贮品质［6］。研究中蒙氏肠球菌在12 h内的生长及产酸速率高于植物乳杆菌，但在12 h后表现较差。研究中，在向日葵副产物中筛选出的3株菌种除蒙氏肠球菌外，并未筛选出其他乳酸菌种，其主要原因是植物原料未经发酵导致其表面微生物附着单一，还可能是由于当地气候和海拔高度对向日葵表面微生物种类分布存在一定影响［26-27］。
3.2 向日葵副产物中的纤维素分解菌酶活力
试验通过对4株进行菌种分子生物鉴定，确定菌株Z2和Z13为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），X14为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），X4与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。研究发现，透明圈直径/菌落直径（D/d）比值反映了菌种降解纤维素能力［28］，3种纤维素分解菌菌株中解淀粉芽孢杆菌降解纤维能力最强，测定3种菌株的CMC糖化酶活力和滤纸酶活性也得到了印证。在玉米秸秆中筛选出的解淀粉芽孢杆菌对木质纤维素有着强降解作用［18］，与研究结果一致。阿氏芽孢杆菌被发现可降解木质素，但目前研究对象多为工业合成的木质纤维素及化合物，很少被用于降解植物中的木质纤维素［29］，研究中阿氏芽孢杆菌对向日葵副产物存在一定的降解能力，但效果不强，阿氏芽孢杆菌在3 d内纤维素酶活性保持较低水平［30］，与研究结果相似。贝莱斯芽孢杆菌不仅能产纤维素酶，还有一定的抑菌作用［31］，研究也发现贝莱斯芽孢杆菌对纤维素降解有一定效果。此外，滤纸酶活性反映了纤维素酶中多种酶协同作用的总效果，CMC糖化酶活力则是外切β-1，4葡聚糖苷酶和内切酶的活力总和。研究中4株菌种的CMC糖化酶活力菌高于滤纸酶活性，纤维素酶中各酶系的协同作用至关重要，某一类酶活性的高低并不能完全证明其降解纤维素效果的强弱。联合接种纤维素分解菌和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）可改善玉米秸秆青贮品质［32］。
4 结 论
4.1
蒙氏肠球菌为向日葵副产物表面附着优势乳酸菌，其虽具有较强的耐盐能力和温度适应范围，但其产酸能力明显弱于植物乳杆菌，在后期调制向日葵青贮饲料须接种外源优质乳酸菌以满足发酵需求。
4.2 在向日葵副产物中筛选出1株解淀粉芽孢杆菌，1株阿氏芽孢杆菌和2株贝莱斯芽孢杆菌。其中，解淀粉芽孢杆菌降解纤维素能力最优。
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Physiological and biochemical characteristics of dominant lactic acid bacteria and cellulolytic bacteria in sunflower By-Products
LI Xiao1，CHEN Yongcheng1，HUANG Rongzheng1，XU Pingzhu2，ZHANG Fanfan1，MA Chunhui1
（1. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832000，China.2.Xingjiang Xu zhihua Grassland Ecology Co.，Ltd，Habahe Xinjiang 836700，China）
Abstract：【Objective】 This study aims to provide a basis for fermented feeds by sunflower by-products.
【Methods】 The dominant lactic acid bacteria and cellulolytic bacteria attached to the surface of sunflower by-products were isolated，extracted and identified，and the physiological and biochemical characteristics of the dominant bacteria were analyzed.
【Results】 3 strains of lactic acid bacteria and 4 strains of cellulolytic bacteria were isolated.The 3 strains of lactic acid bacteria obtained were Enterococcus mundtii.Among the 4 strains of cellulolytic bacteria，strains Z2 and Z13 were Bacillus velezensis，X14 was Bacillus aryabhattai，and X4 was Bacillus amyloliquefaciens.3 strains of lactic acid bacteria grew well under the conditions of 4，10，30 and 45℃，3% and 6.5% NaCl，grew at pH 3.5-9，and did not grow at pH3; among the 4 strains of cellulolytic bacteria，the ratio of transparent circle diameter（D）/colony diameter（d） and enzyme activity in order of size were Bacillus amyloliquefaciens > Bacillus velezensis > Bacillus aryabhattai.
【Conclusion】 Enterococcus mundtii has strong salt tolerance and a wide range of temperature adaptation，but its acid-producing ability is significantly weaker than that of Lactobacillus plantarum.In the actual weight loss rate of the product，the effect of inoculation with Bacillus amyloliquefaciens is the best.
Key words：sunflower byproduct; lactic acid bacteria; cellulolytic bacteria; isolation; identification; enzymatic activity
Fund projects：Ministry of Rural Agriculture：China Agriculture Research System （CARS）;Xinjiang Uygur Autonomous Region High-quality forage industry technology system project（2022XJSC-Z-02）
Correspondence author：
ZHANG Fanfan （1989-）， male， from Urumqi， Xinjiang， Ph.D， associate professor， master tutor， research direction：
forage production and processing，（E-mail）zhangfanfan@shzu.edu.cn
MA Chunhui （1966-）， male， from Hami， Xinjiang， Ph.D， professor，doctoral supervisor， research direction：
forage production and processing，（E-mail）chunhuima@126.com
