王壹民 刘 强
动脉粥样硬化是冠状动脉粥样硬化性心脏病的病理基础，以不稳定斑块破裂或侵蚀导致的血栓栓塞事件是引起急性冠脉综合征（ACS）的主要原因[1]。不稳定斑块包含以大坏死核心为特征的薄纤维帽粥样硬化斑块（TCFA）和侵蚀引起的糜烂斑块[2-3]。目前国内外关于不稳定斑块动物模型的研究报道较少，一般采用高脂饮食喂养诱导斑块形成，但该类模型很少自发斑块破裂或侵蚀，不能很好地模拟人类动脉粥样硬化斑块病变进程[4]。为系统研究不稳定斑块的病理生理特征及观察药物的干预效应，有必要建立一个可重复性高，贴近临床的不稳定斑块动物模型。
目前许多动物模型已经成熟地应用到动脉粥样硬化领域中。小鼠因其繁殖迅速、易于遗传操作以及能够在合理时间范围内监测动脉粥样硬化发生等特性，已成为研究动脉粥样硬化的主要物种[5]。经统计超过95%的动脉粥样硬化研究基于载脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠或低密度脂蛋白受体基因敲除（LDLR-/-）小鼠，其中ApoE-/-小鼠应用最为广泛，约占研究总数的68.6%[6]。与LDLR-/-小鼠相比，ApoE-/-小鼠能更快地形成斑块，并且具有更复杂多样的表型[7]。因此，以ApoE-/-小鼠为基础进行基因操作或外科干预来构建不稳定斑块模型的研究越来越多，本文回顾了近年常用的ApoE-/-小鼠不稳定斑块模型的造模方法、模型特点（见表1），为不稳定斑块模型小鼠的研究提供科学依据。
表1 常见不稳定斑块动物模型特点
2.1 右颈总动脉串联狭窄模型（TS 模型）TS 模型为ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养6 周后，部分结扎距离右颈总动脉起始部1 mm 和4 mm 处血管，形成两处直径为150 μm 的串联狭窄[8]。术后7 周在0～1 mm 处可观察到典型薄纤维帽粥样硬化斑块特征，在4 mm远端则表现出稳定斑块特征。计算流体动力学（CFD）显示TS 模型显著降低了右侧颈动脉血流量（65%），由此在0～1 mm 处形成了较低壁面剪切应力和较高拉伸应力的局部环境。通过对比颈动脉狭窄前后的斑块组成成分，研究者发现在TS 模型中不稳定斑块比稳定斑块拥有更高比例的巨噬细胞、白细胞，更大面积的脂质核心，并且可以自发斑块内血管新生和斑块破裂，腔内血栓形成[9]。TS 模型可提供同一只小鼠不同斑块类型的组织样本，从而可以直接比较稳定/不稳定斑块间的特征，以此探索不稳定动脉粥样硬化的潜在治疗和诊断靶点，但不适用于斑块钙化及斑块侵蚀方面的研究。
2.2 主动脉缩窄模型（TAC 模型）TAC 模型是一种通过外科手术建立的头臂干和左颈总动脉之间的主动脉狭窄构建的压力负荷诱导的射血分数降低性心衰小鼠模型[10]。Marino 等[11]对普通饲料喂养的ApoE-/-小鼠进行主动脉缩窄术，引起近端主动脉收缩压、平均动脉压增高，术后8～25 周进行跑步机试验，同时监测心功能及心电图表现。实验期间约有83%的小鼠死亡，心脏组织学分析显示其中74%存在心梗证据，包括TCFA 破裂和斑块侵蚀引起的血栓栓塞，以及运动相关的急性冠状动脉闭塞，后者表现为严重的心肌纤维化。该模型通过高脂血症及高血压双危险因子诱导小鼠冠状动脉不稳定斑块形成，与其他动脉粥样硬化模型相比，研究者直接观察小鼠冠脉病变，并系统研究心脏相关终点事件，这更加符合人类冠心病的病变部位及心梗事件发生原因。适用于评估冠状动脉病变形成和进展的生物学研究。但该模型要求研究人员具备一定的手术操作技能和手术后监测护理动物的经验。
2.3 左肾动脉和左颈总动脉部分结扎模型（R+C 模型）部分结扎ApoE-/-小鼠左肾动脉及左颈总动脉，造成肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）持续激活和左颈总动脉局部低振荡剪切应力环境，术后正常饲养8 周，即观察到小鼠左颈总动脉不稳定斑块表型，80%的小鼠自发斑块内出血和斑块破裂[12]。与之相比，颈动脉部分结扎组小鼠的斑块内出血和斑块破裂发生率仅为10%，而肾动脉部分结扎组小鼠未观察到不稳定斑块表型。用氯沙坦治疗R+C 模型小鼠后，可拮抗由RAAS 系统激活导致的血压升高，并显著降低斑块内出血、破裂发生率，由此证实内源性血管紧张素Ⅱ作为低剪切应力下颈动脉斑块进展诱导因子的作用。R+C 模型模拟内源性肾血管性高血压及局部切应力变化导致的不稳定斑块形成，但该模型未检测斑块内新生血管形成，对斑块内出血的具体机制未作阐述。
2.4 左颈总动脉电损伤及狭窄模型（Two Hit 模型）Franck 等[13]对正常饮食喂养的ApoE-/-小鼠左颈总动脉施加电流脉冲，术后4 周在损伤近端放置锥形套管，造成电损伤处低振荡剪切应力环境，这种先后两次对同一动脉段的损伤被称为“Two Hit”。研究者发现，电损伤导致内皮细胞慢性激活及修复能力受损，并诱导富含平滑肌细胞和透明质酸的内膜增生，这种纤维内膜几乎没有巨噬细胞和脂质核心，符合人类斑块侵蚀的相关特征。放置套管后造成的血流紊乱环境促进电损伤段管腔内皮细胞脱落，Ly6G+中性粒细胞浸润及血小板活化，最终导致腔内血栓形成。该模型通过纤维内膜增生及血流紊乱环境引起斑块侵蚀，是研究动脉粥样硬化斑块侵蚀表型的全新方法。
2.5 ApoE-/-Fbn1C1039G+/-模型 原纤维蛋白-1（Fibrillin-1，Fbn1）基因的突变会导致马凡氏综合征，这是一种以弹性纤维进行性断裂为特征的遗传性疾病。Van 等[14]利用杂交技术获得具有原纤维蛋白-1基因杂合点突变的载脂蛋白E 敲除小鼠。西方饮食喂养35 周，和ApoE-/-小鼠相比，ApoE-/-Fbn1C1039G+/-小鼠从第5 周开始出现左室功能障碍，表现为舒张末期内径（EDD）、收缩末期内径（ESD）和心脏重量显著增加。实验期间有70%的小鼠猝死，对所有小鼠心脏进行组织学分析显示，96%存在冠状动脉不稳定斑块和心肌梗死证据。ApoE-/-Fbn1C1039G+/-模型避免了机械损伤，但制备该基因修饰小鼠可能需要一定的时间和经济成本，同时猝死的高发生率可能会对研究造成限制。此外，60%以上的ApoE-/-Fbn1C1039G+/-小鼠表现出定向障碍、运动障碍等神经系统症状，TTC染色显示存在脑缺血损伤，提示中风可能是小鼠的死亡原因之一，这些非心血管相关并发症增加了实验的复杂性和潜在的混杂因素。
3.1 斑块成分分析 对斑块内部各组分的分析可以了解斑块的性质。Shiomi 等[15]提出，斑块易损指数=脂质成分（巨噬细胞+细胞外脂质）/肌纤维成分（平滑肌细胞+胶原纤维），适用于整体上评价TCFA 的不稳定性，但不适用于糜烂斑块。安园园等[16]对该公式进行改良，即斑块易损指数=斑块易损成分/纤维帽完整性，可以对两类不稳定斑块进行评价。此外，炎症及免疫细胞在斑块内的分布也备受关注。Guo 等[17]发现，CD163+巨噬细胞通过血管内皮生长因子介导的斑块内微血管生成促进斑块内出血。Leistner 等[18]利用流式细胞术对糜烂斑块进行分析后发现斑块内部CD4+和CD8+T 淋巴细胞选择性富集。
3.2 炎症指标 不稳定斑块的炎症相关生物标志物主要有白细胞介素-1（IL-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等。IL-1 是一种被广泛研究的炎性细胞因子，参与其他促炎细胞因子的产生和血管壁内炎性细胞（如巨噬细胞）的募集等。CANTOS 试验已证实在标准治疗的基础上，应用卡纳单抗（canakinumab）抑制IL-1β 能显著降低心肌梗死患者的心血管事件复发率[19]。MCP-1 具有动员单核细胞至斑块内的作用，Georgakis 等[20]在1199 例因颈动脉狭窄接受动脉内膜切除术的患者中发现，斑块MCP-1 水平与不稳定斑块的组织病理学特征和分子标记物相关，其中，既往有急性脑血管事件的患者斑块MCP-1 水平显著高于无症状斑块患者。Zhao 等[21]使用无水乙醇灌洗右侧颈总动脉段联合西式饮食建立不稳定斑块模型后发现，血清MCP-1 水平与斑块易损性相关。MMP-9 过度表达可促进胞外基质降解，促进斑块不稳定性。Seifert 等[22]对ApoE-/-小鼠右颈动脉植入锥形套管改变其周围血流动力学，通过套管上游管腔低剪切应力环境诱导不稳定斑块形成，相比之下套管下游病变呈现出稳定斑块特征，研究者发现在该模型中不稳定斑块的MMP-9 表达量显著高于稳定斑块。
3.3 斑块侵蚀、斑块破裂和腔内血栓形成 获得病理切片后，对平滑肌细胞或Ⅰ型胶原进行免疫学染色以定位纤维帽，判断纤维帽的连续性及厚度。血栓表面标志物（如CD41）及纤维帽的双染则可在证实存在血栓的基础上观察血栓是否从管腔延伸到破裂斑块内部[11]。若连续切片染色显示血栓位于管腔，邻近斑块但不在斑块内，且血栓附着斑块处内皮细胞核覆盖缺失，或见纤维帽增厚，则可排除斑块破裂，考虑是由斑块侵蚀触发腔内血栓形成。此外，连续切片的内皮和平滑肌细胞染色有助于证实破裂斑块脱落。目前对不稳定斑块的解释多为TCFA，最终导致斑块破裂及血栓形成。而表面侵蚀的斑块病理特征与TCFA 不同，该类斑块缺乏脂质及巨噬细胞浸润，富含平滑肌细胞及Ⅲ型胶原，以内皮细胞激活为起点，斑块侵蚀逐渐导致中性粒细胞聚集，内皮细胞死亡、脱落及壁血栓形成[23]。Franck 等[13]对ApoE-/-小鼠左颈总动脉进行电刺激造成内膜损伤，4 周后在损伤近端动脉放置袖带，造成损伤处血流紊乱及振荡壁面剪切应力，模拟人斑块侵蚀等相关病理过程。
3.4 斑块内新生血管和斑块内出血 斑块内局部缺氧及炎症微环境会诱导外膜血管滋养管进入内膜，形成斑块内新生血管[24]。在定量计算时通过CD31 免疫学染色得出斑块内新生血管数量。CD31 和α-SMA 的双染则可评估新生血管的成熟度，成熟血管表现为完全由平滑肌细胞覆盖的单层内皮细胞，而未成熟血管仅呈现内皮细胞层。对血小板的染色可以测定斑块内出血的程度。此外，在设计药物对斑块内新生血管的影响实验中，研究者有时会加用基质胶塞实验（Matrigel plug assay）以直接评估药物对血管新生的作用[25]。
在脂质谱和脂蛋白代谢方面，小鼠的主要循环血脂是高密度脂蛋白（HDL），其血浆胆固醇的运输主要通过HDL 来完成。ApoE 是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）受体的配体，该基因的敲除导致血浆胆固醇以VLDL 的形式升高，而不是LDL。此外，ApoE 还参与合成细胞（主要是骨髓来源的巨噬细胞/单核细胞系）的其他生物学功能[5，26]。在病变分布方面，小鼠动脉粥样硬化好发于主动脉根部和头臂动脉、左颈动脉、锁骨下动脉的分支点，这些病变部位并不是导致人类心血管疾病的主要区域，由于组织收集大小的限制，小鼠的冠脉病变并不容易被观察到。尽管存在这些差异，转基因小鼠对于我们理解动脉粥样硬化的分子机制和潜在治疗途径仍是非常宝贵的[27]。
目前由TCFA 破裂导致ACS 的概念已得到广泛接受，随着他汀类药物的普及，TCFA 可转变为更稳定的形态特征，作为ACS 的另一种机制，纤维帽完整的糜烂斑块导致的急性冠状动脉综合征（IFC-ACS）逐渐引起关注。该类病变涉及内皮完整性的破坏，在内皮剥脱区域易形成血栓，而不破坏覆盖在斑块表面的纤维帽[28]。Leistner 等[18]通过光学相干断层扫描（OCT）对170 例ACS 患者的冠脉罪犯病变分析发现，IFC-ACS 约占ACS 的三分之一，但其潜在的病理生理机制仍不明确。当前所建立的临床前动物实验病变所多为TCFA，尚无被广泛接受的模拟人类斑块侵蚀的动物模型，需要进一步探索和研究。
猜你喜欢硬化斑块血栓山东：2025年底硬化路铺到每个自然村今日农业(2022年14期)2022-09-15防栓八段操 让你远离深静脉血栓中老年保健(2021年8期)2021-12-02颈动脉的斑块逆转看“软硬”自我保健(2021年2期)2021-11-30一篇文章了解颈动脉斑块妇女之友(2021年9期)2021-09-26microRNA-146a与冠心病患者斑块稳定性的相关性昆明医科大学学报(2020年11期)2020-12-28血栓会自己消除么? 记住一个字，血栓不上身！基层中医药(2020年10期)2020-11-27Apelin-13在冠状动脉粥样硬化病变临床诊断中的应用价值天津医科大学学报(2019年6期)2019-08-13有颈动脉斑块未必要吃降脂药百姓生活(2019年2期)2019-03-20血栓最容易“栓”住哪些人基层中医药(2018年4期)2018-08-29磨削硬化残余应力分析与预测制造技术与机床(2017年6期)2018-01-19
