杨曼琪 吴钢 刘韬 崔博 居昊 刘哲宇 任宗力 曹省 颜敏 张帆
室性早搏(PVC)是一种常见的室性心律失常。越来越多的临床证据表明有的频发性PVC会引起心脏结构和功能变化,引起PVC 心肌病(PVC-ICM)[1],但PVC-ICM 的具体机制尚不完全清楚。线粒体作为人体重要的代谢工厂,其稳态对细胞活性至关重要[2]。越来越多研究发现,线粒体异常与心脏疾病关系密切,如心力衰竭、心肌梗死、扩张型心肌病以及糖尿病性心肌病等[3－5]。而线粒体异常是否与PVC-ICM 有关尚不清楚,笔者通过建立PVC-ICM 犬模型,观察犬心功能变化及线粒体超微结构,以探索PVC-ICM的机制,为临床PVC-ICM 患者的远期恢复寻求新的潜在线索。
1.1 动物分组
14只成年比格犬(体重10～12 kg/只)购自武汉大学人民医院实验动物中心,随机分为对照组(CTL,n＝7)和模型组(PVC-ICM,n＝7)。实验设计和实施均通过武汉大学人民医院实验动物福利伦理委员会审批(WDRM20201007)。
1.2 PVC-ICM 模型的制作
1.2.1 在全身麻醉下,14 只比格犬接受了起搏器的植入。无菌准备后,切开右侧颈部,暴露颈外静脉,在X 线透视下将两根双极起搏电极送入右室。将心房电极置于右室游离壁,心室电极植于右室心尖部(图1 A)。心房电极与双腔起搏器(Insync III,Medtronic,Minneapolis,MN)的心房端口(atrial port)相连接,用于感知窦性心室波,心室电极与起搏器心室端口(ventricular port)相连接,用于起搏心室。设置起搏参数,心室感知5 m V,起搏阈值1 V,起搏电压设置为2 V。启动起搏器,确认成功感知自身窦性心律和起搏右室后,固定电极并关闭起搏器。将起搏器置于颈外侧囊袋中,缝合颈部伤口。由于起搏器数量有限,我们分3 批给犬植入起搏器,第一批:3 只CTL组和3只PVC-ICM 组;第二批:3只CTL组和3只PVC-ICM 组;第三批:1只CTL组和1 只PVC-ICM 组。
图1 安装起搏器后犬胸部X 线影像侧位图及PVC程序程控前后犬心电图的变化
1.2.2 参数设置 手术完成1周后,PVC-ICM 组将起搏器设置为VDD 模式。电极1感知到窦性心律后,由电极2提前释放一次早搏刺激,通过这种方式模拟起源于右室心尖的持续二联律PVC。通过调节电极1 感知窦性心室波后与电极2 释放电冲动之间的时间间隔(即起搏器房室延迟时间)来模拟PVC与前次窦性心室波的联律间期(CI),CI固定为350 ms。犬基础心率为120分/次,窦性搏动周长为500 ms,故而设置CI长度为窦性周长的75%,即350 ms。每2周对犬进行1次心电图监测,观察心电图以确定起搏器持续有效起搏。CTL 组犬起搏器不启动程序。
1.3 超声心动图评估心功能
于基线及PVC 程控起搏开始后每2周对各组动物进行一次超声心动图检查(Vivid E9,GE,US)。测量左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)、左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、左室后壁厚度(LVPWT)、舒张末期室间隔厚度(IVST)。每次超声心动图检查前关闭起搏器至少15 min,以获得准确的参数。
1.4 透射电子显微镜
犬造模结束后,注射过量戊巴比妥钠将犬处死,取部分心室游离壁组织,切割成1 mm3大小的立方体,固定于2.5%的戊二醛中,4℃保存2 h至完全固定,1 mmol/L 的磷酸缓冲液冲洗,1%四氧化俄固定4℃2 h,包埋于环氧树脂中,包埋液固化,醋酸铀染色后于透射电镜(JEOL JEM1200EX,日本电子公司)下进行拍照分析。使用ImageJ软件(NIH)测量线粒体的大小、面积和数量。
1.5 统计分析
所有统计检验均使用GraphPad Prism 软件(La Jolla,CA)进行。计量资料采用均数±标准差(±s))表示,两组间比较采用t检验。计数资料用率表示,采用卡方检验。以P＜0.05为差异有显著性。
2.1 一般情况
整个造模期间,CTL 组犬精神状况良好,总体情况无明显变化;PVC-ICM 组在造模后期有5只犬陆续出现进食减少,活动量少,精神萎靡等症状。
2.2 两组超声指标的比较
与CTL 组 相 比,PVC-ICM 组 起 搏12 周 后,LVEF和FS显著降低,LVESD 和LVEDD 增加(P＜0.05),见表1。
表1 12周后2组犬的心脏超声指标
2.3 线粒体超微结构的比较
与CTL 组比较,PVC-ICM 组起搏12周后,心肌细胞呈不规则形状,心肌间质有胶原沉积,线粒体形态不规则,网络结构融合,并表现出异常的嵴(图2);每个显微视野下线粒体数量减少[(93.29±6.02)个vs(112.43±11.85)个,P＜0.001],体积增大[(2.42±0.18)μm2vs(1.54±0.19)μm2,P＜0.001],每个视野下线粒体面积增大[(225.63±18.88)μm2vs(171.37±19.64)μm2,P＜0.001]。
图2 12周后2组犬线粒体超微结构变化的比较
本研究通过建立PVC-ICM 犬模型,主要发现:①频发性PVC可导致心功能障碍。②频发性PVC会导致线粒体超微结构改变,包括线粒体数量增多,体积增大,线粒体嵴融合。
2011年,Huizar等[6]首次采用右室心外膜起搏方案成功建立PVC-ICM 模型,在他们的研究中,模型组观察到左室功能障碍,这与本研究结果一致。除此之外,Huizar等使用Masson染色在光镜下并未观察到心肌间质纤维化改变,而本研究使用电镜发现心肌间质有胶原沉积。造成这种差别的原因可能是因为Huizar等采用的观察仪器是光镜,而本研究采用电镜,观察的结果更加细微。也有可能是因为Huizar 等的模型采用的是短联律间期(CI＝250ms)起搏模式,而本研究的模型采用的是长联律间期(CI＝350ms)起搏模式。已有多项临床研究发现长CI是PVC-ICM 的危险因素,CI延长,患者患PVC-ICM 的 风 险 越 大[7－8]。2016 年Tanaka等[9]通过心内膜起搏方式在猪身上建立CI为320ms的PVC-ICM 模型,除了发现模型组心功能障碍,还发现心肌间质明显的纤维化,这与本研究结果一致。心肌纤维化改变可能是部分患者抑制PVC 后心功能不能恢复的一个原因。
正常情况下,线粒体通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷,为心肌细胞的正常收缩和代谢提供能量,维持细胞稳态[10],心肌细胞的病理生理学与线粒体的变化有关,包括肿胀、嵴膜丧失、结构变形或心室内外空泡[11],故而线粒体形态和功能的稳定性对于维持正常的心脏生理功能尤为重要。Ashrafian等[12]在Dnm1突变的小鼠模型中观察到与线粒体复合体水平降低、心脏三磷酸腺鞋苷(ATP)耗尽和心力衰竭相关的线粒体网络延长,首次证明参与线粒体重塑的基因缺陷可能导致心肌病。Abdullah等[13]同样发现线粒体异常与心功能障碍有关。在本研究中,PVC-ICM 组线粒体数量增多、形态不规则、结构紊乱,网络结构融合,这表明线粒体异常可能是PVC-ICM 的一个原因。
频发性PVC 导致心室线粒体超微结构损伤的机制目前尚不清楚,笔者猜测可能与线粒体Ca2＋超载有关。Walters等[14]在猪模型中发现,相较于对照组,PVC-ICM 组磷酸化的兰尼碱受体2(p-RYR2)、钠钙交换器-1(NCX-1)、钙依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca MKⅡ)的蛋白水平均上调。Ca MKⅡ对心肌细胞Ca2＋稳态发挥重要的调节作用,其过度激活可对L 型Ca2＋通道(ICa-L)、Ry R2及受磷蛋白(PLB)等多种Ca2＋运转关键蛋白进行磷酸化修饰[15－16],一方面可引起ICa-L开放时间显著延长,增加心肌细胞Ca2＋内流,另一方面还可引起Ry R2 舒张期异常开放,增加舒张期Ry R2的Ca2＋泄露,这些改变可最终导致心肌细胞内Ca2＋蓄积。而线粒体Ca2＋稳态是线粒体稳态的一个重要方面,在细胞生理和病理过程中发挥着一系列关键作用,包括能量代谢、细胞凋亡和活性氧(ROS)的产生[17]。Santulli等[18]发现Ca2＋通过Ry R2从内质网泄露导致线粒体内Ca2＋超载,在心力衰竭中起关键作用。线粒体Ca2＋超载会导致线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)的打开,允许小于1.5 k Da 的分子自由通过[19]。这会导致线粒体膜电位的破坏、膜通透性的改变、线粒体渗透肿胀、线粒体破裂、ATP 合成减少以及细胞色素C 从膜间释放[19]。此外,mPTP 的开放和随后线粒体的解偶联还会导致胞浆ATP 的活性水解和胞浆中ATP 含量的减少。综上所述,线粒体内Ca2＋超载可能是频发性PVC造成线粒体异常的一个机制,但需要进一步研究证实,明确相关机制将为临床PVC-ICM 患者的治疗提供理论依据。
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