庄利萍 ，王开昕 ，王 芳 ，叶 宏
（1）都江堰市中医医院病理科，四川 都江堰 611830;2）昆明医科大学基础医学院病理学与病理生理学系，云南 昆明 650500;3）华中科技大学协和深圳医院病理科，广东 深圳 518052）
头颈部鳞癌中最常见的是喉癌，占所有癌症死亡的1%[1]，据文献报道[2]预计2022 年中国（不包括台湾省）将有大约3 万人新诊断出喉癌，1.7万人死于喉癌；
其中，新发病例男性约2.7 万人，女性约0.3 万人；
死亡病例男性约1.4 万，女性约0.3 万。喉乳头状瘤，儿童发病多于成人，成人有恶变倾向，因此，喉癌的癌前病变是喉乳头状瘤[3−4]。喉息肉多由慢性炎症、刺激等因素引起的，发病率占喉部良性肿瘤的20%以上[5]。
目前，关于喉鳞状上皮病变的不同阶段（喉息肉、喉乳头状瘤、喉鳞状细胞癌）关系比较的报道少见。而喉癌目前的治疗方法仍以手术为主，但传统手术方法创伤较大，且术后患者生存质量较低。随着微创手术概念的兴起，需要对喉癌作出早期诊断，并正确估计患者治疗后的预后，以便选择合理的治疗方法，避免造成不必要的创面并尽最大可能地保留喉的功能。当前，肿瘤患者手术方法的确定和预后的评价主要基于肿瘤的临床分期，但同一分期的喉癌患者常常显示出不同的临床过程，这就表明单一的TNM 分期对于喉癌患者预后的推测存在不足。为此，本课题主要通过免疫组化检测增殖分化相关基因COX2、CDX2在喉息肉、喉乳头状瘤、喉鳞癌中的表达，同时探讨检测指标与喉癌患者预后之间关系以找出判断喉鳞癌预后的最佳免疫组化检测指标，为喉鳞癌患者预后判断和治疗方案的选择提供一定的理论依据。
1.1 研究材料
1.1.1 样本资料样本选自昆明医科大学第二附属医院手术切除的临床资料完整的存档蜡块，共51 例。全部病例术前均未经放疗和化疗。其中，喉息肉15 例、喉乳头状瘤11 例、喉鳞癌25 例；
25 例喉鳞癌样本，高分化8 例，中分化11 例，低分化6 例。淋巴结有转移8 例，淋巴结无转移17 例。男性23 例，女性2 例，年龄39～79 岁，平均62.12 岁。按WHO 喉癌TNM 分类标准[6]：T1～T2 期16 例，T3～T4 期9 例。4%中性甲醛固定，5 µm 连续切片。
所有患者的随访以电话方式进行，随访日期从病理报告确诊日期算起，至2008 年12 月，严格记录随访情况。共随访到25 例喉鳞癌患者，失访0 例；
随访结局定义为死亡。
1.1.2 主要试剂COX2 即用型兔抗人单克隆抗体、CDX2 即用型鼠抗人单克隆抗体、DAB 显色试剂盒、即用型非生物素免疫组化EliVisionTMplus 检测试剂盒等均为美国Maxin 公司产品，购自福州迈新生物技术有限公司。
1.2 研究方法
1.2.1 免疫组化染色步骤严格按试剂盒说明进行。每次实验均设阳性对照和阴性对照。
细胞质和/或细胞膜为COX2 主要着色部位，淡黄色～棕黄色。细胞核为CDX2 主要着色部位，呈淡黄色。
采用HPIAS-1000 高清晰度病理图文分析系统对免疫组化结果进行定量分析。每个样本均在400 倍下，按无偏采样原则取5 个视野，每个视野测定5 个细胞。最终结果由阳性单位（positive unit，PU）来判断[7]。
1.3 统计学处理
2.1 COX2 蛋白免疫组化检测结果
COX2 在喉鳞癌组织中的表达低于喉息肉、喉乳头状瘤中的表达（图1～3），差异有统计学意义（P=0.004，P=0.001），在喉息肉和喉乳头状瘤中阳性着色集中于棘细胞层和颗粒细胞层；
T3-T4 期喉鳞癌COX2 表达比T1-T2 期高，且差异有统计学意义（P=0.001）；
有淋巴结转移喉鳞癌组高于无淋巴结转移喉鳞癌组，低、中、高分化喉鳞癌中的表达逐渐升高，但差异均无统计学意义（P>0.05），见表1～2。
表1 COX2 在喉息肉、喉乳头状瘤 和喉鳞 癌中的表达（）Tab.1 The expression of COX2 in laryngeal polyps，laryngeal papilloma and laryngeal squamous cell carcinoma（）
表1 COX2 在喉息肉、喉乳头状瘤 和喉鳞 癌中的表达（）Tab.1 The expression of COX2 in laryngeal polyps，laryngeal papilloma and laryngeal squamous cell carcinoma（）
与喉鳞癌比较，▲P <0.05。
表2 COX2 在喉鳞癌中的表达与临床病理参数之间的关系（）Tab.2 The relationship between the expression of COX2 and clinicopathologic parameters in laryngeal squamous cell carcinoma（）
表2 COX2 在喉鳞癌中的表达与临床病理参数之间的关系（）Tab.2 The relationship between the expression of COX2 and clinicopathologic parameters in laryngeal squamous cell carcinoma（）
图1 COX2 在喉息肉中的表达IHC（比例尺：100 µm×200）Fig.1 Expression of COX2 protein in laryngeal polypus IHC（100 µm×200）
图2 COX2 在喉乳头状瘤中的表达IHC（比例尺：100 µm×200）Fig.2 Expression of COX2 protein in laryngeal papilloma IHC（100 µm×200）
2.2 CDX2 蛋白免疫组化检测结果
CDX2 在喉息肉、喉乳头状瘤（图4～5）中多为弱阳性～阳性表达，阳性细胞散在分布，喉鳞癌（图6）中未表达CDX2，但两两比较差异无统计学意义（P>0.05），见表3。
表3 CDX2 在喉息肉、喉乳头状瘤和喉鳞癌中的表达（）Tab.3 The expression of CDX2 in laryngeal polyps，laryngeal papilloma and laryngeal squamous cell carcinoma（）
表3 CDX2 在喉息肉、喉乳头状瘤和喉鳞癌中的表达（）Tab.3 The expression of CDX2 in laryngeal polyps，laryngeal papilloma and laryngeal squamous cell carcinoma（）
图4 CDX2 在喉息肉中的表达IHC（比例尺：100 µm×200）Fig.4 Expression of CDX2 protein in laryngeal polypus IHC（100 µm×200）
图5 CDX2 在喉乳头状瘤中的表达IHC（比例尺：100 µm×200）Fig.5 Expression of CDX2 protein in laryngeal papilloma IHC（100 µm×200）
图6 CDX2 在喉鳞癌中呈阴性表达IHC（比例尺：100 µm×200）Fig.6 Negative expression of CDX2 protein in laryngeal squamous cell carcinoma IHC（100 µm×200）
2.3 COX2 的表达与喉鳞癌患者预后的关系
单因素生存分析中，COX2 阴性表达的喉鳞癌患者1 a、3 a、5 a 生存率高于COX2 阳性表达的喉鳞癌患者，COX2 阴性表达的喉鳞癌中位生存期比COX2 阳性表达的长，但是，两者比较差异无统计学意义（P>0.05），见表4 和图7。
表4 COX2 的表达与喉鳞癌患者预后的关系Tab.4 Relationship between expression of COX2 and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma patient
图7 COX2 蛋白表达阳性和阴性喉鳞癌患者的生存曲线Fig.7 Survival curves of patients with positive and negative COX2 protein expression
3.1 COX2 的表达特点及分析
喉鳞癌是一种高度致残的疾病，影响患者的语言、吞咽和呼吸技能[8]，临床上早期诊断极为重要。环氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX2）作为体内前列腺素生物合成的限速酶，其蛋白由604个氨基酸组成，表皮生长因子结构域、膜结合结构域及酶活性结构域，构成其基本结构。人COX2 基因位于1 号染色体1q25.2～25.3 上，全长约8.3 kb，含10 个外显子和9 个内含子[9]。COX2 被认为是一种“应答基因”，在健康组织中呈低表达或不表达[10−11]，而在多种癌前病变和恶性病变时呈高表达[12]。其在体内呈诱导性表达，在被细胞内外各种刺激因素如脂多糖、白介素-1、血小板激活因子等因素所诱导下表达COX2。病理情况下，COX2 参与炎症及肿瘤的形成[13−14]。研究显示，COX2 与喉鳞癌[15−16]、食管鳞癌[17]和头颈部鳞癌[18]的淋巴结转移及预后有关，而有报道[19−20]却发现口腔鳞癌的复发或生存率与COX2无关，因此，在头颈部鳞癌中，COX2 的表达无预后意义。本实验发现COX2 在喉鳞癌中的表达低于喉息肉和喉乳头状瘤中的表达，表明COX2参与了炎症反应及喉鳞癌的发生；
COX2 在喉鳞癌低、中、高分化的表达逐渐升高，但其表达差异无统计学意义；
随着喉鳞癌临床分期的增高，COX2 的表达也增加，且差异有统计学意义。笔者认为COX2 在不同病理阶段含量不同，对肿瘤细胞的促增殖作用也不同。
本实验还发现喉鳞癌中有淋巴结转移组比无淋巴结转移组的COX2 阳性表达高，但差异无统计学意义。考虑与标本量太少有关。COX2 表达阴性的喉鳞癌患者比阳性的患者中位生存期长，差异无统计学意义，故笔者认为COX2 不能预测喉鳞癌患者的预后。
3.2 CDX2 的表达特点及分析
CDX2 基因，包括3 个外显子和2 个内含子，全长22～23 kb，蛋白含311 个单氨基酸，与DNA 的相应区域结合，方式为螺旋-环-螺旋，DNA 表达的调节靠转录因子的形式。这种核同源异构体转录因子，调控着组织的分化和增殖[21−22]。
据报道，CDX2 是胆管癌[23]和胰腺浸润性导管癌[24]患者预后的指标之一；
CDX2 对Barrett 食管进展的早期检测具有潜在的预后效用，其表达可显著预测初次活检后40～ 45 个月杯状细胞肠化生发生的风险[22]。有学者推测CDX2 对肠上皮的鉴别、发生发展起着重要作用[25]，是结直肠腺癌[26]的标志物，具有高度特异性和敏感性，CDX2 的表达可能有助于乳腺Paget 病的分型[27]；
但也有学者认为CDX2 多态性不能作为预测中国人结直肠癌易感性的有用标记[28]。60 例食管鳞癌中CDX2 的阳性率为5%，而CDX2 在43 例肺鳞癌中仅2 例为散在阳性，42 例膀胱鳞癌中也发现有CDX2 表达，但表达较少为1 例，提示CDX2在鳞癌中表达极低[29]。
本实验发现CDX2 在喉息肉、喉乳头状瘤中多为弱阳性～阳性表达，CDX2 在喉鳞癌中不表达，且差异无统计学意义，初步推测CDX2 可能不是喉鳞癌的危险因素。
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