黄夏荣 周君 孙光华 彭昕珂 廖源 刘静 罗敷 钟培瑞 彭婷 胡莉芝
南华大学衡阳医学院附属第一医院1康复医学科、康复医学中心、康复医学实验室，3肛肠科（湖南衡阳 421001）；
2广州医科大学附属第六医院，清远市人民医院康复科（广东清远 511500）
骨关节炎（OA）是一种伴有软骨下骨病变的关节软骨退行性疾病［1］。目前OA 的临床治疗以保守治疗为主，西医多采用药物治疗，中医治疗手段丰富，其中电针作为一种重要的中医治疗方法，其治疗OA 的疗效确切。临床研究显示［2］，电针能缓解膝骨关节炎患者疼痛，改善膝关节的功能。基础研究显示电针能抑制软骨细胞降解［3］，缓解软骨细胞退变［4］。近年来，巨噬细胞极化在OA 中的作用越来越受到关注，M1 型巨噬细胞是促炎性细胞，而M2 型巨噬细胞是抗炎性细胞，两者维持动态平衡，当受到外界刺激时可互相转化。有报道显示［5］M1 和M2 型巨噬细胞动态失衡时可反映OA 的严重程度，当M1/M2 型巨噬细胞比例增大时，OA 病理损伤越严重。本研究通过电针干预老年大鼠，观察电针治疗对老年大鼠关节软骨及软骨下骨极化相关蛋白表达的影响。
1.1 实验动物16 只24 月龄SD 雄性大鼠，体质量（709 ± 93）g ，8 只6 月龄SD 雄性大鼠，体质量（501 ± 23）g，由长沙天勤生物技术公司提供，合格证号CXK（湘）2019-0015，饲养于南华大学动物部，自由饮食饮水。实验方案经南华大学衡阳医学院附属第一医院医学伦理委员会批准（批准号：202005110032）。实验过程中，遵循《关于善待实验动物的指导性意见》等相关规定。
1.2 主要试剂及仪器血清Ⅱ型胶原C 端肽试剂盒（中国北京，康为世纪，批号C0681257875），Micro-CT（美国GE 公司，eX-plore Locus SP 型），台式冷冻离心机（中国湖南湘仪，型号H1650R），荧光定量RCP 仪（美国Thermo，型号PIKOREAL96），荧光PCR 板（美国Thermo，型号SPL0960），电泳仪（中国北京六一，DYY-2C），水平琼脂糖电泳槽（中国北京六一，型号DYCP-31DN），mRNA 逆转录试剂盒（中国北京康为世纪，批号CW2569），miRNA 逆转录试剂盒（中国北京康为世纪，批号CW2141），Trizol（美国Thermo，批号15596026），华佗牌电针仪（苏州医疗用品有限公司，型号SDZ-V），华佗牌一次性无菌针（0.25 mm × 25 mm，苏州医疗用品厂有限公司）。
1.3 分组与造模24 月龄SD 雄性大鼠16 只，随机分为老年组和电针组，每组8 只；
8 只6 月龄SD雄性大鼠为青年组。通过自然衰老方式复制骨关节炎动物模型［6］。
1.4 干预方法电针组接受电针干预，大鼠四肢固定于鼠板，参照《实验动物常用穴位名称与定位第2 部分：大鼠》［7］取穴：双侧“太溪”、“足三里”、“阳陵泉”、“血海”。进针深度约3～5 mm，电针参数：疏密波，疏波频率3 Hz，密波15 Hz，电流强度1 mA，30 min/次，1 次/d，每周5 d，连续8 周。其余两组不干预。
1.5 主要观察指标2%戊巴比妥钠（80 mL/kg）腹腔注射进行麻醉。本研究参照课题组前期研究［8］，摘除大鼠眼球，于眼眶取血用于ELISA 法检测Ⅱ型胶原C 端肽（CTX-Ⅱ）；
切取左侧胫骨平台2 cm 左右骨标本，左胫骨多聚甲醛固定用于Micro-CT 检测；
番红-固绿染色观察左胫骨平台软骨组织形态学结构；
右侧胫骨平台用于RT-qPCR、Western blot 检测。
1.5.1 ELISA 检测外周血CTX-Ⅱ 大鼠眼眶取血3 mL，2～8 ℃1 000 ×g离心外周血15 min，取上清，按ELISA 试剂盒说明检测CTX-Ⅱ水平。
1.5.2 Micro-CT 检测左胫骨微结构左胫骨多聚甲醛浸润24 h，冰箱保存。置于Micro-CT 下扫描，观察各组大鼠骨密度（BMD），骨体积分数（BV/TV），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁数量（Tb.N），骨小梁间距（Tb.Sp）。
1.5.3 番红-固绿染色Micro-CT 检测后，左胫骨EDTA 脱钙，脱水，石蜡包埋，常规切片。将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，无水乙醇5 min，95%酒精5 min，85%酒精5 min，蒸馏水冲洗10 min。将切片放入1%番红染液染色2 h，蒸馏水冲洗，放入50%，70%，80%梯度酒精脱色各1 min。切片放入0.5%固绿染液中染色30～60 s。无水乙醇Ⅰ中脱色30 s，无水乙醇Ⅱ中脱色1 min。切片烤干后于二甲苯透明5 min，中性树胶封片。
1.5.4 Mankin"s 评分用改良Mankin＇s 评分量表［9］，评估左胫骨平台软骨组织形态结构，包括软骨结构，软骨细胞，染色情况，潮线4 个方面。具体评估标准如下，软骨结构：软骨表面正常0 分；
表面不规则，有裂隙1 分；
表面有裂隙，达移行层2 分；
裂隙到辐射层3 分；
裂隙达钙化层4 分；
软骨脱落，无法分清结构5 分。软骨细胞：正常0 分，弥散增多1 分；
出现大量细胞聚集2 分；
细胞数量明显减少3 分。染色情况：正常0 分，轻度减少1 分；
中度减少2 分；
重度减少3 分；
染色消失4 分。潮线：正常0 分，多重潮线1 分，血管入侵潮线2 分。
1.5.5 RT-qPCR 法检测大鼠右侧胫骨平台各指标mRNA表达水平取组织约0.02 g，加入1 mL Trizol，按Trizol 法提取软骨及软骨下骨中总mRNA，以组织总mRNA 为模板，逆转录cDNA。检测右侧胫骨平台基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）、基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、巨噬细胞甘露糖受体（MMR）、精氨酸酶1（Arg1）mRNA 表达水平。运用primer5 软件设计引物，由北京擎科合成引物，引物序列见表1。
表1 引物信息Tab.1 Primer sequence
1.5.6 Western blot 检测大鼠右侧胫骨平台各指标蛋白的表达水平取关节软骨组织约0.025 g，用PBS 清洗，加入300 μL RIPA 裂解液反复研磨，12 000 r/min 离心20 min 提取蛋白。配制10%的分离胶，4.8%浓缩胶制胶，开始电泳，电泳恒定电压75 V，时间为130 min，300 mA 恒定电流转膜。按比例稀释一抗，二抗。一抗MMP1 以1∶1 000，MMP3、MMP13 以1∶5 000，TNF-α 以1∶1 000，IL-1β以1∶1 000，MMR 以1∶1 000，Arg1 以1∶5 000 比例稀释。二抗HRP goat anti-mouse IgG 以1∶5 000 比例稀释。封闭抗体孵育，ECL 发光液暗室曝片，显影冲洗，用quantity oneV4.6.2 专业灰度分析软件进行分析。检测右侧胫骨平台MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 蛋白表达水平。
1.6 统计学方法采用SPSS 26.0 软件进行数据分析，计量数据符合正态分布以表示，组间采用单因素方差分析，两两比较若方差齐性采用LSD 检验，方差不齐则采用Dunnetts T3 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 CTX-Ⅱ含量比较青年组、老年组、电针组大鼠CTX-Ⅱ水平依次是（1.62 ± 0.271）、（4.24 ±0.558）、（2.74±0.414）ng/mL。与青年组相比，老年组大鼠外周血中CTX-Ⅱ含量增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与老年组大鼠相比，电针组大鼠外周血中CTX-Ⅱ水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.2 左膝关节软骨下骨显微CT 比较显微CT 显示，青年组大鼠骨小梁结构完整，数量较多，排列紧密，骨小梁间距较小；
与青年组相比，老年组大鼠骨小梁结构异常，数量明显减少，排列稀疏，骨小梁间距增大；
与老年组相比，电针组大鼠骨小梁数量有增加，排列较紧密，间距减小，见图1。
图1 各组大鼠左膝关节软骨下骨显微CT 比较Fig.1 Comparison of micro-CT scan of subchondral bone of left knee joint in each group
2.3 左胫骨微结构比较与青年组相比，老年组大鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数量减少，差异有统计学意义（P＜0.05），骨小梁厚度、骨小梁间距增大，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与老年组相比，电针组骨密度、骨体积分数、骨小梁数量增加，差异有统计学意义（P＜0.05），骨小梁间距减少，差异有统计学意义（P＜0.05），骨小梁厚度有减小的趋势，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。
表2 各组大鼠软骨下骨微结构比较Tab.2 Comparison of subchondral bone microstructure of rats in each group ±s
注：与青年组比较，*P＜0.05；
与老年组比较，#P＜0.05
组别青年组老年组电针组例数8 8 8 BMD（g/cm3）0.31 ± 0.303 0.19 ± 0.0285*0.26 ± 0.051#BV/TV（%）18.48 ± 2.359 8.46 ± 2.306*13.98 ± 4.913#Tb.Th（mm）0.09 ± 0.007 0.10 ± 0.005*0.10 ± 0.011 Tb.N（1/mm）2.10 ± 0.206 0.82 ± 0.236*1.38 ± 0.494#Tb.Sp（mm）0.33 ± 0.036 0.81 ± 0.121*0.63 ± 0.209#
2.4 软骨组织番红-固绿染色比较青年组大鼠软骨表面平整，软骨细胞数量正常，排列整齐有序，形态结构正常，染色均匀。老年组大鼠软骨表明结构破坏严重，软骨与软骨下骨分解不清，钙化严重，出现多重潮线，细胞数量明显减少，出现裂层，细胞形态结构异常，染色不均。电针组软骨表明稍平整，未见明显裂层，软骨细胞数量较老年组有所增加，染色较均匀。见图2。
图2 各组大鼠关节软骨组织番红O-固绿染色比较（× 200）Fig.2 Comparison of fuchsin O-fast green staining in articular cartilage of rats in each group（× 200）
2.5 Mankin"s 评分比较青年组、老年组、电针组大鼠Mankin＇s 评分依次是（0.75 ± 0.463）、（10.63 ±1.847）、（5.75 ± 1.035）分。与青年组相比，老年组Mankin＇s 评分增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与老年组相比，电针组Mankin＇s 评分降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.6 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表达比较与青年组相比，老年组大鼠右侧胫骨平台MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表达水平增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；
与老年组相比，电针组MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、4、图3。
图3 各组大鼠MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表达水平比较Fig.3 Comparison of MMP-1，MMP-3，MMP-13 protein expression in different groups of rats
表3 各组大鼠基质金属蛋白酶mRNA 表达比较Tab.3 Comparison of mRNA expression of matrix metalloproteinases in different groups ±s
表3 各组大鼠基质金属蛋白酶mRNA 表达比较Tab.3 Comparison of mRNA expression of matrix metalloproteinases in different groups ±s
注：与青年组比较，*P＜0.05；
与老年组比较，#P＜0.05
组别青年组老年组电针组例数5 5 5 MMP-1 0.994 ± 0.407 8.523 ± 1.748*4.631 ± 3.387#MMP-3 1.682 ± 0.498 21.534 ± 5.120*13.181 ± 2.343#MMP-13 1.280 ± 0.492 8.502 ± 1.519*5.538 ± 0.967#
表4 各组大鼠基质金属蛋白酶的蛋白表达水平比较Tab.4 Comparison of protein expression level of matrix metalloproteinases in different groups ±s
表4 各组大鼠基质金属蛋白酶的蛋白表达水平比较Tab.4 Comparison of protein expression level of matrix metalloproteinases in different groups ±s
注：与青年组比较，*P＜0.05；
与老年组比较，#P＜0.05
组别青年组老年组电针组例数5 5 5 MMP-1 0.292 ± 0.010 0.584 ± 0.010*0.450 ± 0.087#MMP-3 0.172 ± 0.089 0.524 ± 0.107*0.296 ± 0.106#MMP-13 0.254 ± 0.040 0.484 ± 0.082*0.370 ± 0.070#
2.7 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表达比较与青年组相比，老年组大鼠右侧胫骨平台TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表达升高，而MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；
与老年组相比，电针组TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表达降低，而MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表达升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表5、6、图4。
表5 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1mRNA 表达比较Tab.5 Comparison of the expression of TNF-α，IL-1β，MMR and Arg1mRNA ±s
表5 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1mRNA 表达比较Tab.5 Comparison of the expression of TNF-α，IL-1β，MMR and Arg1mRNA ±s
注：与青年组相比，*P＜0.05；
与老年组相比，#P＜0.05
组别青年组老年组电针组例数5 5 5 TNF-α 0.942± 0.271 3.889± 0.729*2.358± 0.589#IL-1β 1.659± 0.849 15.283± 3.807*9.475± 2.547#MMR 0.927± 0.185 0.259± 0.074*0.719± 0.094#Arg1 1.032± 0.179 0.283± 0.107*0.726± 1.177#
表6 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 蛋白表达比较Tab.6 Comparison of TNF- α，IL-1 β，MMR and Arg1 protein expression ±s
表6 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 蛋白表达比较Tab.6 Comparison of TNF- α，IL-1 β，MMR and Arg1 protein expression ±s
注：与青年组比较，*P＜0.05；
与老年组比较，#P＜0.05
组别青年组老年组电针组例数5 5 5 TNF-α 0.210± 0.112 0.660± 0.168*0.412± 0.113#IL-1β 0.114± 0.080 0.534± 0.113*0.348± 0.089#MMR 0.416± 0.088 0.126± 0.068*0.246± 0.098#Arg1 0.620± 0.078 0.318± 0.015*0.462± 0.043#
中医认为，骨关节炎属“骨痹”。本病的发生以肾精亏虚为本，还与外邪侵袭、劳损过度等有关。《灵枢·邪气藏府病形篇》曰：“……筋急，阳陵泉主之”。研究表明［10］火针刺激阳陵泉，可缓解膝骨关节炎患者疼痛、僵硬及活动障碍。《灵枢》指出“著痹不去，久寒不已，卒取其三里骨为干”。谈倩等［11］研究显示针刺结合艾灸刺激足三里能有效抑制大鼠炎症因子的表达，缓解软骨退变。血海是足太阴脾经上的重要穴位，具有化血为气，运化脾血之功能；
太溪为肾经俞穴，可滋阴益肾，壮阳强腰，故本研究采用以上穴位进行刺激。
本研究中，大鼠左胫骨平台软骨组织番红-固绿染色显示，大鼠左胫骨软骨组织结构破坏严重，钙化严重，出现多重潮线，细胞数量明显减少，表明骨关节炎模型复制成功。改良Mankin＇s 评分是学术界公认评估骨关节炎软骨退变程度的通用标准，共14分，得分越高，表明软骨退变越严重。本研究中老年组大鼠改良Mankin＇s 评分10.625±1.847，说明老年组大鼠膝关节软骨退变严重。
CTX-Ⅱ是Ⅱ型胶原降解产物之一，因其不易被降解，具有较高的稳定性和可靠性，因此CTX-Ⅱ常被当作评估OA 软骨降解的标志物［12］。目前普遍认为，CTX-Ⅱ的表达水平与OA 软骨降解程度成显著关系。当软骨降解时，CTX-Ⅱ表达升高；
反之，当降解被抑制时，CTX-Ⅱ表达降低。孙光华等［3］研究表明，电针刺激去卵巢大鼠，能显著降低尿液中CTX-Ⅱ的含量。史晓伟等［13］研究也表明，电针能降低兔膝骨关节炎关节液中CTX-Ⅱ的表达水平。在本研究中，老年组血液中CTX-Ⅱ较青年组CTX-Ⅱ升高，说明老年组大鼠关节软骨发生了降解。电针干预后，电针组CTX-Ⅱ降低，说明电针干预能抑制大鼠关节软骨的降解。这与上述研究结果［3，13］一致。
有研究表明［14］，OA 早期软骨下骨局部可形成骨质疏松。在一项电针治疗骨质疏松大鼠的研究中显示［15］，电针可使大鼠骨密度升高，骨体积和骨小梁数量增加。钟培瑞等［8］研究显示，电针可提高老年骨质疏松大鼠的骨密度。本研究通过对大鼠左胫骨平台Micro-CT 分析显示，电针能使老年大鼠骨密度，骨体积分数，骨小梁数量均增加，骨小梁间距降低。说明电针干预能够改善老年大鼠骨质疏松。
关节软骨主要由软骨基质和软骨细胞组成，其中软骨基质占绝大部分。在正常情况下，软骨基质合成与降解维持动态平衡，当OA 发生时，平衡被打破。基质金属蛋白酶（MMPs）是一种基质降解酶，由炎性细胞、成纤维细胞等分泌而来，在软骨基质合成与分解过程中起到重要作用。MMPs 有多种亚型，所有亚型具有类似的结构，均由10 个外显子和9 个内含子组成，且具有分解蛋白质的能力。有研究显示OA 发生后，MMPs 各亚型在体内的表达都升高［16］。相关研究证实MMP-1、MMP-3、MMP-13 等与OA 的发生过程有着密切关系［17-18］。在本研究中，老年组大鼠MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表达较青年组均升高，这表明老年组大鼠软骨及软骨下骨发生了降解；
电针干预后，电针组大鼠MMP1、MMP3、MMP13 mRNA及蛋白的表达均降低，这表明电针干预能够抑制老年大鼠软骨及软骨下骨降解，从而保护关节软骨及软骨下骨。类似的结果在其他相关研究中也得到了证实［19-22］。
巨噬细胞是主要的免疫细胞，巨噬细胞极化与OA 有着密切关系［23］。巨噬细胞可分为经典活化型巨噬细胞（M1 型）和替代活化型巨噬细胞（M2型）［24］，其中M1型巨噬细胞通过分泌IL-1β、TNF-α、NO 等细胞因子，发挥促炎症反应作用［25-26］；
M2 型巨噬细胞通过分泌Arg1、MMR、类抵抗素a（Fizzl）、类几丁质酶（Ym1）等细胞因子，发挥抑制免疫反应、促进组织修复的作用［27-28］。有研究表明，巨噬细胞向M2 型表型极化，可减轻大鼠的疼痛和软骨退化［29］；
还可释放某些因子，对组织愈合和成骨分化发挥免疫调节作用［30-31］，而M1 型极化会导致组织损伤［32-33］。因此，促进巨噬细胞向M2 型转化，有助于改善OA 关节内稳态，促进组织修复，抑制软骨细胞退变。在本研究中，老年组大鼠TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表达较青年组大鼠均升高，MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表达降低，说明老年组大鼠软骨及软骨下骨可能向M2 型极化减少；
电针干预后，电针组大鼠TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表达较老年组大鼠均降低，MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表达升高，说明电针干预能促进软骨及软骨下骨向M2 型极化。
综上所述，电针可能通过促进老年大鼠OA 关节软骨及软骨下骨M2 极化，缓解关节软骨降解及抑制软骨下骨骨质疏松，从而达到保护关节的作用。需指出的是，电针的参数国内尚未统一，本实验所用的参数参考了国内既往相关研究，具有一定的局限性。
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