马春英，王美皓 综述，马忠仁，王家敏 审校
1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；
2.西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；
3.甘肃省生物工程材料工程研究中心，甘肃 兰州 730010；
4.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030
从1962年Capstick等成功进行BHK21细胞的悬浮培养开始，动物细胞进入了规模化生产阶段，发展至今已成为生物医学领域研究和应用中广泛采用的技术方法［1］。动物细胞规模化培养技术主要是指在控制温度、溶氧、pH、流体动力学、营养物质和代谢产物浓度等参数条件下，依附于生物反应器的悬浮培养和贴壁培养。而动物细胞贴壁培养作为分泌产物（如重组蛋白和病毒）等生物制品规模化生产的基本技术支持，其大规模培养技术一直是业内研究和关注的焦点，尤其对大规模培养基质载体技术的开发和实施，从20世纪50年代至今未停止过［2-3］。
作为细胞培养基质，其材料需具有物理结构简单、有效的高表面积和机械稳定性、不含动物源性成分、耐高压性和化学及生物惰性等特性。目前市售的细胞培养基质主要包括离子交换交联葡聚糖、纤维素、玻璃纤维、胶原蛋白、明胶、海藻酸钙、聚乳酸-乙醇酸、三甲基铵包被聚苯乙烯、聚氨酯、聚赖氨酸／氟碳乳液以及聚酯纤维等天然高分子材料［4-5］，而以聚酯纤维高分子材料为基质的片状载体作为动物细胞高密度培养的一种有效载体之一，在疫苗生产、细胞治疗和组织工程等不同医疗应用中具有重要意义。
片状载体又称纸片载体或大载体，主要是由医用级高分子化合物聚酯纤维［聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）］通过静电超声波纺丝技术热黏合加工成多孔结构的无纺布基材，进一步经焊接、成型、清洗和表面改性处理等工艺后，制备的用于贴壁依赖型细胞和悬浮细胞培养的片状固体支持生长基质［6-7］。目前，结合填充床生物反应器的片状载体技术高密度灌注培养模式，在生物制品研发和实际生产中得到了广泛应用［8］。本文从片状载体的研究现状、基质材料的合成构建、材料表面基质的设计、细胞培养环境系统以及在不同医疗制品生产中的应用等方面作一综述，为后期片状载体的继续研发以及选择片状载体进行规模化生产提供参考。
从20 世纪80 年代至今，在片状载体的研究、应用和销售领域，国外一直保持领先地位，已研制出各种不同类型的片状载体。1976年，SPIER等［9］利用纤维圆形片状载体（Fibra-Cel disks）成功实现了BHK-21 细胞的培养。之后各种不同类型的片状载体相继出现，见图1。这些载体材料相似，仅形状和结构有所不同，主要分为以聚丙烯（polypropylene，PP）为支架的聚酯圆片载体，如纤维圆片载体（Fibra-Cel disks）［10-11］，以及由100%聚酯纤维制成的各种不同形状的片状载体，如多层菱形纤维载体（BioNOCⅡ™）和各种微型聚酯片状载体等［12-16］。由于结合填充床生物反应器灌注培养模式的片状载体技术避开了传统球状微载体的不足，自动化程度高且经济实惠，一出现便迅速抢占市场。如德国Eppendorf 公司的Fibra-Cel disks结合New BrunswickTMCelliGen®生物反应器，可从0.7 L至150 L 进行动物细胞大规模商业化生产。中国台湾CESCO 公司的BioNOCⅡTM多层片状载体结合Tide Cell®生物反应器，可从500 mL小试规模放大至5 000 L的生产规模，是世界上唯一一款可进行大规模细胞收获的培养系统［12］。
图1 不同类型片状载体Fig.1 Different types of fibracel carriers
由于国内动物细胞大规模培养技术起步较晚，规模化生产能力和技术创新实力相对较弱，在片状载体的研发及生产上一直处于起步阶段，尤其载体原材料受限，主要依赖进口。因此，国内生物制药领域急需加快片状载体原材料的研发及生产。上海楚鲲生物科技有限公司、中生天信和生物科技有限公司、兰州百灵生物技术有限公司及武汉赛科成科技有限公司等也一直在开展片状载体的研究工作。其中中生天信和生物科技有限公司宣称开发了从原材料、关键技术到核心工艺全面国产化的产品编码为ZT 的Cellcomb 载体，摆脱了一直以来片状载体高度依赖进口的“卡脖子”困境［13］。
片状载体作为动物细胞大规模培养的载体基质，其良好的生物相容性以及细胞培养效果主要由载体材料的表面性能和基于载体的整个培养环境的提供及优化共同组成。
2.1 合成构建依据 作为细胞培养基质材料，最基本的条件就是蛋白质吸附。而吸附蛋白层的组成和结构取决于材料表面的化学和物理性质，以及细胞响应和黏附强度。细胞的黏附是由整合素引起。整合素是一种位于细胞膜上的受体蛋白，其与被吸附的蛋白层相黏附，之后，由于应力纤维（肌动蛋白丝）的形成，细胞开始扩散和增加表面接触面积，最后形成细胞附着点，从而引起细胞的黏附及生长。而片状载体作为哺乳动物细胞体外培养基质，其合成构建的研究方向主要集中在材料的各种理化性质等表面特性的优化以及不同形态的研究及开发，包括表面化学结构、电荷分布、孔径大小和表面粗糙度等均能影响细胞贴壁和黏附效果。适度亲水性的材料更有利于诱导细胞黏附［17］，材料表面引入羰基（-C=O）、羧基（-COOH）和羟基（-OH）等含氧基团，可改善其与细胞的生物相容性；
而含氮基团的引入不仅能改善亲水性，还能影响材料表面电荷分布以及与细胞膜上蛋白质肽链产生相互作用等，从各个角度促进细胞的黏附生长［18］。粗糙表面有利于生物膜的迅速再生长，更有利于细胞的贴壁黏附［19］。多孔结构有利于营养物质的渗透和细胞正常代谢，也对细胞的黏附生长有积极作用，且孔径的大小对细胞生长也有影响，如用不同孔径尼龙网培养3T3 成纤维细胞，小孔径尼龙网的细胞量远高于大孔径尼龙网［20］。因此，载体基质材料表面条件的优化与重组，一直是其合成制备工艺中的重要组成部分。
2.2 表面基质优化 聚酯纤维类聚合物PET 作为片状载体的主要材料，其形成的3D 网状空间立体结构织物具有良好的耐酸碱、耐热性及无毒、不可生物降解等特点，刚度适中、柔韧性好，对高流体应力有很好的耐受性。对于细胞培养而言，是一个极具经济效益和良好结构优势的基质材料［16］。主要缺点为疏水性强，表面能低，不具备细胞识别位点，影响细胞黏附及生长［21］。需进行一定的表面改性修饰以增强其生物相容性和细胞亲和性。目前文献报道最多的表面改性方法主要有化学法、常压等离子体法和辐射接枝法等。其中，运用最多的为化学接枝法和常压等离子体法。如OZAKI 等［22］通过1-乙基-3-（二甲氨基丙基）盐酸碳二亚胺交联水溶剂将凝集素I（ulex europaeus I，UEAI）与PET 共价结合，实现了低聚糖介导的内皮细胞的特异性黏附；
DESAI 等［23］在PET 表面共价结合强亲水性聚乙烯氧化物（polyethylene oxide，PEO）改善其亲水性；
PET 也可在碱性溶液中部分水解，使表面基团转变产生羟基，与乙二胺反应引入胺基，通过亲水性基团的含量提高细胞生物相容性［17］；
TURKOGLU 等［24］通过低压H2O／O2等离子体处理NWPE（non-woven polyethylene）无纺布，使牙周韧带成纤维细胞的增殖和活力均获得改善；
刘伟等［16］通过氩气等离子体处理在PET 支架上接枝与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）特异性结合的L-NH2半乳糖内酯配体，使支架表面产生胺基和羧基等基团调节其细胞生物相容性，有效促进肝细胞的黏附、增殖、高密度生长和分化；
利用氩气等离子体将碳纳米颗粒（carbon nano particles，CNPs）接枝到PET 表面，也可增强血管平滑肌细胞的黏附及增殖［25］；
而Fibra-Cel disks 载体通过甲醇清洗和静电技术处理后，产生了净结合电荷，使细胞流过载体时截获至内部纤维并贴附生长，从而增强细胞的黏附及生长［7］。另外，还可通过辐射引起PET 表面大分子的降解生成自由基，而参与接枝的单体同时受辐射引发，与大分子链上的自由基产生接枝反应；
如用激光束照射处理PET，通过增加极性基团而提高PET 的极性，从而修饰其表面特性［26］。
2.3 细胞培养微环境 以聚酯纤维为基质的片状载体作为细胞生长基质的新选择广泛应用于各种细胞规模化培养，除了材料表面基质优化设计诱导细胞黏附生长，还主要依赖于载体自身宏观的结构特点以及在不同类型生物反应器中培养细胞时提供的培养环境。
首先，就载体本身而言，高表面积与体积比为细胞贴附和生长提供了更多的有效面积，如Fibra-Cel disks 载体有效面积为1 200 cm2／g，BioNOCⅡTM多层片状载体可达2 400 cm2／g，其三维立体空间结构和高孔隙率，在细胞培养过程中形成吸附面和保护层，减少了载体内扩散限制，可对细胞进行高效的捕获及吸附，使细胞均能贴附在片状载体的表面和内部纤维上生长。见图2。固定在反应器罐内的片状载体相互堆积，贴附在载体上的细胞可迁移至临近载体上增加其相互作用，使片状载体不仅对细胞的接种密度要求低，还使细胞的贴附和生长迅速［27-29］；
一般以1×106cells／mL 的初始密度接种，片状载体在15 ～60 min 即可迅速完成贴附，且几乎所有贴壁细胞均能在片状载体上生长，除一般贴壁细胞外，更有利于如MRC-5 和293T 细胞等一些黏附性较低，难以附着的细胞培养［30］。目前成功用于片状载体的细胞有123A、127A、GAMMA、67-9-B、DA4-4、3T3、Tn-368、Sf9、rSf9、Hi-5、Vero、MDCK、HEK293、BHK、ST、MRC-5、COS、CHO 细胞及小仓鼠肾细胞、基质细胞、肝细胞和人成纤维细胞等［31-35］。
图2 片状载体3D模拟及细胞生长图Fig.2 3D simulation and cell growth diagram of fibracel carriers
其次，片状载体培养系统主要是指在控制温度、溶氧、pH、流体动力学、营养物质和代谢产物浓度等参数条件下，为细胞生长提供极具生理学特性的微环境。目前主要依靠篮式生物反应器、潮汐式生物反应器和激流式生物反应器等填充床生物反应器完成，这些反应器的设计主要针对载体固定化与悬浮、床层等各种培养方式之间的相互关系。如篮式生物反应器配有提升桨，通过提升桨旋转产生离心力将细胞培养液从溢流口甩出，致使搅拌桨内部的导管形成负压并产生吸力，将罐体底部的培养液吸入导管内。而从溢流口流出的培养液自上而下流穿床层内固定的载体，从而实现培养液载体罐体内的循环。导管底部设置有气体分布器，培养基在导管内部获得氧气供应，并避免通气产生的泡沫与细胞接触。提升桨顶部增设消泡腔，对导管内产生的泡沫进行收集并消除，有效降低了因机械搅拌以及泡沫破裂产生的剪切力。激流式生物反应器采用分体设计，分为激流细胞培养袋和灌注细胞培养袋两部分，载体置于灌注细胞培养内，通过表层通气方式进行无泡通气，再通过振荡器振荡细胞培养袋产生激流，增加气液接触面和液体混合性能，在最大振荡速度［120 r／（min·kLa）］下，混合培养液通过蠕动泵泵入灌注细胞培养袋中，为细胞提供营养物质，而流穿的培养液回流至激流细胞培养袋中，往复循环培养。而潮汐式反应器同样采用分体式设计，反应器分为储液罐和载体罐，片状载体装填于载体罐。通过对储液罐中正压或负压的控制，将培养液周期性地从储液罐压入载体罐并浸润片状载体，再吸回至储液罐使载体暴露空气中。当培养液浸润载体时，细胞吸收培养液中营养物质，当载体暴露于空气中时，细胞获得空气中氧气。储液罐采用表层通气，通过搅拌的方式进行混合［23］。这些填充床生物反应器的独特设计，在细胞规模化培养过程中降低剪切应力对细胞毒性效应的同时，还有效扩大了细胞产量。一般填充床生物反应片状载体的装载量可达30 ～40 g／L，收获的细胞量高达108cells／mL［36］。另外，再结合灌注培养模式，使细胞在培养过程中实现高效的氧传递效率和营养物质的及时补充，以及代谢产物的及时去除，从而使细胞在培养过程中实现持续的高密度和高活力生长，通常可超过1 ～2个月，并且不会发生堵塞的风险［34］。
随着生物制药领域的不断发展，以动物细胞为基质的生物制品的规模化生产对当代生物技术的发展具有极其重要的意义。而片状载体作为提供哺乳动物及昆虫细胞生长的一种固体支持基质，除用于前期实验研究和商业生产中动物细胞的规模化培养外，主要还应用于以下几个方面。
3.1 在疫苗生产中的应用 疫苗作为预防和控制传染病爆发最有效的手段，在公共卫生防护安全中具有重要作用。细胞源病毒疫苗的生产作为疫苗生产的主要方法，需要高密度细胞来实现更高的疫苗生产水平。片状载体培养系统为高滴度病毒疫苗生产提供了一个理想平台。其高密度和高活力细胞灌注培养模式，不仅为病毒扩增提供了相对稳定的培养环境，还延长了病毒培养时间并增加了收获量，在一定程度上减小了批间差异、缩小了生产空间和时间，在降低经济投入的同时保证了产品均一性［33］。而由于载体对细胞有一定的截留作用，在获取细胞收获液时，无需采用旋转过滤器或沉降柱等细胞截留装置，使收获液中的细胞、宿主蛋白和DNA 含量降低，相较于其他培养系统，更有利于下游纯化，可降低整体疫苗生产的成本［36］。
另外，大规模生产疫苗需要大量种子细胞接种培养，若使用转瓶或细胞工厂进行种子链扩增，增加了成本和污染风险。同时，低传代和高传代细胞系间的基因表达和表型也存在差异［37］。而片状载体培养则不存在该方面的困扰，非常有助于扩大疫苗生产的需求，广泛应用于大规模病毒疫苗生产。
片状载体目前已成功用于日本脑炎、流感、牛疱疹、裂谷热、牛结节疹、脊髓灰质炎、肾综合症出血热、猪瘟、小反刍动物麻疹、猪腹泻、杆状病毒及腺相关病毒的高滴度培养，为疫苗的规模化生产提供了更多的选择［34-38］。并且，随着新冠疫情的爆发，片状载体技术也被广泛应用于新冠疫苗的规模化生产，如北京生物制品研究所有限责任公司的SARS-CoV-2全病毒灭活苗就是通过片状载体制备的［39-40］。
3.2 在治疗类生物制品生产中的应用 片状载体培养技术除了在病毒疫苗生产中具有优势外，在其他多种重组蛋白细胞因子、干扰素、激素、单克隆抗体等的规模化生产中同样具有优势，包括世界上首个批准上市的基因治疗产品“今又生（Gendicine）”就是利用Fibra-Cel disks 载体培养技术制备的［41］。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞天生对代谢废物堆积比较敏感，独特的灌注式片状载体培养可满足杂交瘤细胞生长的特定需求［40］；
而在慢病毒载体制备中，利用片状载体培养技术不仅可提高PEI 转染效率，降低PEI 毒性对细胞的持续影响，还可连续灌流收获病毒液，提高病毒收获液总量，在制备出高滴度慢病毒原液同时，降低了后期纯化的压力，从而提高了慢病毒的质量和产量［33，42］。另外，有研究证明，结合Fibra-Cel disks 载体技术，组织纤维溶酶原激活蛋白等重组蛋白的表达活性相较于传统微载体可提高十几倍［32］。
3.3 在组织工程中的应用 人类疾病的细胞治疗和组织再生需大量细胞，片状载体培养技术除了具有生产大量细胞的巨大潜力外，在组织工程和再生医学中也具有较广泛的应用前景，如在干细胞的应用评估以及生物人工肝等各种体外器官模型的构建中，提供比常规培养更稳定的培养环境［17］。
大量功能细胞的生产一直是临床应用的一大挑战，尤其是干细胞，如骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）体外扩增培养后，会表现为表型改变、细胞缺失及快速老化［43］。因此，干细胞稳定的体外放大培养方法成为近年来再生医学领域关注的一个重要课题。而一般广泛应用于干细胞研究的大规模培养系统主要是T 型烧瓶和旋转烧瓶，虽然是一种可行和简单的培养方法，但在控制pH 值、氧压力、代谢活性等，以及可扩展性方面是有限的。
因此，片状载体培养技术在干细胞的应用评估中具有重要意义。有研究表明，在Fibra-Cel disks 片状载体上，干细胞（如MSCs）可分泌广泛的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），并能更好地保持其茎干性和增殖潜力的固有特性，可用于大规模的人造血干细胞扩张［42］；
而由纤维连接蛋白（fibronectin，FN）共轭的片状载体支架（polyethylene terephthalate，PET），可实现人造血干细胞（hematopoietic stem cells，HCS）的体外扩增［43］；
TSAI等［44］也证明，Fibra-Cel disks载体在500 mL一次性生物反应器中可扩增产生（4.15 ±0.81）×108个／mL人类脐带血来源的骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）。
另外，VENTRE 等［45］利用片状载体基质PET 薄膜制成一种用于哺乳动物细胞高密度贴壁培养的可伸缩滚转支架（roll support，RS），实现了小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）的成功培养等。因此，随着现代生物技术的飞速发展，片状载体在组织工程和再生医学中将会展示出更高的应用价值。
如今市面上超过一半的治疗性生物制品均是通过动物细胞生产的，而以动物细胞为基质的疫苗生产更被认定为现代疫苗技术的支柱。因此，快速实现各种动物细胞的规模化培养是现代生物制药行业发展的重点。
以高分子材料聚酯纤维为基质的片状载体技术已成为大规模生产细胞的关键技术手段之一，广泛用于疫苗生产、细胞治疗和组织工程等不同医疗应用中［46-47］。但片状载体仍存在一些有待解决的问题，如不可重复利用；
在培养过程中无法实时监测细胞生长状态，且细胞位于纤维微结构深处，营养物质和氧气供应不充分，细胞生长不均匀；
不易消化；
由于载体自身对细胞的截留，使细胞收获不完全等［35-36，48］。总之，片状载体在生物制品生产应用中具有巨大的优越性，如何攻克其弊端和缺点，有待进一步研究。
目前我国在片状载体技术上的研发虽初有成效，但在原材料的精细化研究以及更高层次的规模化应用研究上仍面临巨大挑战。这一挑战不仅体现在优化出具有良好生物相容性、促使细胞黏附生长等的载体原材料本身的结构特点，还包括与其相匹配的生物反应器的理想设计，在保证良好生物相容性的同时，提供与生理学相关的培养环境是片状载体技术成功的关键。而这一难题，除了材料科学，还需生物工程、流体力学和分析化学等综合学科的介入。本文从片状载体的研究现状、载体特性以及应用方面进行了详细介绍，以便了解片状载体目前的研究状况及今后发展趋势，为片状载体技术的继续研发以及生产上的应用提供参考。
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