吴慧敏 夏盼盼 吴海潮 陈万昭 秦 蕾 徐琦琦 刘泽鹏 夏利宁
(新疆农业大学 动物医学学院/新疆草食动物新药研究与创制重点实验室,乌鲁木齐 830052)
食源性疾病是威胁公共安全最重要的因素之一[1],而沙门菌是一种广泛分布于自然界、人和动物肠道中常见的食源性致病菌[2]。我国每年约有三亿人因感染沙门菌而患病,占所有致病菌引起食源性疾病的70.0%～80.0%,其中由肉类造成沙门菌传播高达90.0%以上[3]。防治沙门菌病最有效且常用的手段是应用抗菌药物,但由于抗菌药物的滥用,沙门菌的耐药性逐渐增强,甚至产生了多药耐药菌株。日渐严重的耐药问题给畜牧业的良性发展和人类的身体健康带来了严重危害[4]。
猪是沙门菌的第二大宿主[5],在猪只养殖过程中,沙门菌极易通过粪便、水、土壤、饲料和空气等传播给养殖人员[6],尤其是在集中规模化的养殖方式下,畜禽数目庞大,养殖空间狭小,加剧了传播风险[5]。有研究表明,在养殖过程中抗菌药物的使用与人群中耐药菌株的增加有关联[7]。目前,我国沙门菌耐药性研究多局限于人或动物,较少综合性报道人、动物和环境中沙门菌的耐药情况。故本研究在新疆某规模化猪场中,将采集的人、动物和环境源样品中分离的沙门菌作为研究对象,了解其在猪场中的流行情况,比较3种来源沙门菌的耐药性和携带耐药基因的情况,并提供消杀和用药建议,降低沙门菌的传播和耐药菌产生的风险。同时,提示人们关注沙门菌等人畜共患病原菌在环境中存在的风险,提高自我保护意识及建立抗菌药物正确使用意识。
1.1 材料
1.1.1菌株
2021年6月在新疆奇台县某规模化猪场采集人、动物和环境样品共855份,其中猪肛拭子407份(腹泻猪肛拭子75份、经产猪肛拭子272份、后备猪肛拭子60份)、环境样品412份(产房环境样品70份、保育环境样品150份、其他环境样品156份、养殖人员鞋底样品36份)及养殖人员粪便样品36份。大肠埃希标准质控菌(ATCC 25922)购自杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.2培养基、试剂及药品(抗菌药物)
MH(Mueller-Hinton)培养基、氯化镁孔雀绿增菌液(Rappaport-Vassiliadis Medium,MM)、SS琼脂培养基(SalmonellaShigella Agar)均购自奥博星生物技术有限公司(北京);甘油和50×TE缓冲液购自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL 2 000 DNA Maker,2×TaqPCR Master Mix、dd H2O、琼脂糖与核酸染料均购自天根生化科技(北京)有限公司;药敏试验用抗菌药物购自上海源叶生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1细菌分离鉴定
将采集的样品拭子放入装有灭菌MH肉汤的EP管中混匀,吸取20 μL MH肉汤至1 mL灭菌MM增菌液中,于摇床37 ℃培养48 h后用灭菌接种环在SS琼脂培养基上划线培养18～24 h,培养基上的中间黑色周围透明的菌落,可初步鉴定为沙门菌,对疑似沙门菌的菌株进行持家基因invA的PCR扩增[8]。扩增产物经加核酸染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后,将目的片段进行胶回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果经美国国家生物技术信息中心网站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)比对,相似性>96.0%判定为沙门菌,20.0%灭菌甘油-80 ℃保存备用。
1.2.2药物敏感性试验
采用琼脂稀释法对分离株进行11种抗菌药物最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentrations,MICs)的测定,测试药物包括养殖场常用抗菌药物以及部分备选抗菌药物:氨基糖苷类(阿米卡星、庆大霉素)、喹诺酮类(恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星)、β-内酰胺类(氨苄西林、头孢噻呋、亚胺培南)、四环素类(四环素、多西环素)和酰胺醇类(氟苯尼考),测试所用抗菌药物敏感性判断标准及具体试验操作按照美国临床实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)[9]推荐的动物源细菌抗菌药物敏感性试验执行标准进行。
1.2.3耐药基因检测
对不同来源的沙门菌进行氨基糖苷类(ant(3″)-Ia、aac(6′)-Ib)、喹诺酮类(oqxA、oqxB、qnrS)、β-内酰胺类(blaCTX-M、blaTEM、blaNDM)、四环素类(tetA、tetM)和酰胺醇类(floR)耐药基因进行检测。所用耐药基因的引物见文献[10-16],由生工生物工程(上海)有限公司合成上述引物。
1.2.4数据分析
采用SPSS 19.0软件对不同来源沙门菌分离率、耐药率与基因检出率进行差异性分析,P<0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著。
2.1 猪场中人、动物和环境源沙门菌的分离鉴定
该猪场母猪存栏量大约为2 300头,年产合格健仔数约为67 000头,养殖场常用四环素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、青霉素类和酰胺醇类抗菌药物作为防治性药物使用。本研究以855份新疆奇台县某规模化养猪场采集到的人、动物和环境源样本为研究对象,共分离得到288株沙门菌,分离率为33.7%。人源沙门菌的分离率最高,为47.2%(17/36),猪源沙门菌的分离率为33.9%(138/407),环境源沙门菌的分离率最低,为32.3%(133/412)。其中猪源样品中腹泻猪源和经产猪源沙门菌的分离率较高,分别为42.7%(32/75)和37.9%(103/272),而后备猪源沙门菌的分离率仅为5.0%(3/60);环境源样品中产房环境源沙门菌的分离率高达77.1%(54/70),工人粪源沙门菌(47.2%,17/36)与工人鞋底源沙门菌(41.7%,15/36)的分离率相近(表1)。结果表明该猪场人-动物-环境源样品中均能检出沙门菌,且人源沙门菌的分离率最高,其次是猪源和养殖场中的环境源。
表1 养猪场人-动物-环境来源的沙门菌分离情况Table 1 Isolation rates of Salmonella from human-animal-environment in the pig farm
2.2 猪场中人、动物和环境源沙门菌耐药及多药耐药情况
猪场分离的288株沙门菌对四环素(86.1%,248/288)、多西环素(84.4%,243/288)、氟苯尼考(79.9%,230/288)和氨苄西林(78.5%,226/288)的耐药率较高,均在75.0%以上;未检出对左氧氟沙星和阿米卡星耐药的菌株,仅检出4株对头孢噻呋耐药的菌株和6株对亚胺培南耐药的菌株。
3种来源沙门菌的耐药严重程度由高到低为:环境源沙门菌、人源沙门菌、猪源沙门菌。环境源沙门菌对氟苯尼考(92.5%,123/133)的耐药率显著高于猪源沙门菌的耐药率(P<0.05);环境源沙门菌对恩诺沙星(70.7%,94/133)的耐药率显著高于猪源沙门菌(9.4%,13/138)和人源沙门菌(11.8%,2/17)的耐药率(P<0.05);环境源和人源沙门菌对四环素、多西环素、氨苄西林、环丙沙星和庆大霉素的耐药率均在52.0%以上,显著高于猪源沙门菌的耐药率(P<0.05);该猪场沙门菌对亚胺培南和头孢噻呋的耐药率较低,均低于3.0%,耐药菌株仅在猪源和环境源中检出(表2)。
表2 不同来源沙门菌对11种抗菌药物的耐药率Table 2 Resistance rate of Salmonella from different sources to 11 kinds of antibiotics %
猪场分离的沙门菌多药耐药在0～8耐均有分布,共有30种耐药谱型,3耐及3耐以上的菌株占81.3%(234/288);多药耐药菌株以7耐为主(34.0%,98/288),其中GEN-TET-DOX-CIP-ENO-FFC-AMP谱型最多(33.0%,95/288);7耐菌株主要从环境源沙门菌中检出,占65.4%(87/133),仅从环境源沙门菌中检出1株8耐菌株;猪源沙门菌中以4耐菌株为主,检出率为47.8%(66/138);人源沙门菌中以6耐菌株为主,检出率为41.2%(7/17)(表3)。结果表明该猪场不同来源沙门菌的耐药情况严重,耐药谱广,耐药表型种类多,其中环境源沙门菌耐药情况最为严峻。
表3 猪场人-动物-环境来源的沙门菌多药耐药率Table 3 Multidrug resistance rate of Salmonella from human-animal-environment sources %
2.3 猪场中人、动物和环境源沙门菌的耐药基因检测
该猪场分离的沙门菌中β-内酰胺酶耐药基因blaTEM的检出率为100.0%,猪源和人粪源菌中分别检出7株(5.1%)和1株(6.3%)blaCTX-M基因阳性菌,此外,2株猪源沙门菌中检出blaNDM基因;环境源和人源沙门菌中氨基糖苷类耐药基因ant(3″)-Ia和aac(6′)-Ib的检出率均大于70.0%,高于猪源沙门菌;70株(50.7%)和68株(49.3%)猪源沙门菌检出四环素类耐药基因tetA和tetM,检出率显著高于环境源和人源沙门菌(P<0.05);喹诺酮类耐药基因oqxA和oqxB在环境源和人源的沙门菌中检出情况相同,各检出104株(78.2%)和9株(52.9%)携带上述2种基因的沙门菌,且同时携带2种基因的菌株占阳性菌株的98.2%(111/113);猪源沙门菌中共检出65株(47.1%)qnrS基因阳性菌株,显著高于环境源和人源沙门菌的检出率(P<0.05)(表4)。结果表明该猪场不同来源沙门菌中携带的耐药基因种类多,以blaTEM、ant(3″)-Ia和floR基因的检出率较高,基因共存情况严重,环境源沙门菌的耐药基因检出率最高。
表4 猪场人-动物-环境来源的沙门菌耐药基因检出率Table 4 Detection rate of drug resistance genes in Salmonella from human-animal-environment sources %
3.1 猪场中人源沙门菌分离率高于养殖环境源和猪源
沙门菌是引起人畜共患病及食物中毒的主要食源性致病菌之一,没有中间宿主,在自然界中广泛分布,给畜牧养殖业和公共卫生安全造成了潜在危害[17]。本研究中沙门菌总分离率为33.7%,以人源沙门菌分离率最高,达到47.2%,高于新疆乌鲁木齐市人源沙门菌的检出率[18]。养殖业规模的快速发展,虽然减少了养殖场养殖人员的数量,但是养殖人员与带菌动物的接触却更加频繁了[19-20]。Su等[21]研究表明,猪是沙门菌的主要动物宿主,沙门菌极易通过粪-口途径感染给其服务业工人。本研究中环境源沙门菌与猪源沙门菌的分离率(32.3%～33.9%)相近,但低于郭昱含[22]报道的我国不同地区饲料厂工人鞋底上沙门菌的检出率,远高于吉林省猪源沙门菌的分离率[23]。通过与该场工作人员交流,分析其原因可能是在样品采集时正逢怀孕母猪进入围产期,孕猪所在圈舍无法按时进行消杀,导致环境中及工人鞋底上沙门菌的检出率高。并且,本研究中有腹泻症状猪只的沙门菌分离率较高,其腹泻的原因可能是沙门菌的直接感染或继发感染。多项研究表明,疾病的传播过程会涉及人、动物和环境3个层面,当病原体存在于废水、土壤及其他环境中时,通过相关储存宿主或媒介,极易导致动物或人感染疾病[24]。此外,养殖人员鞋底与自身粪便的带菌情况有较密切的相关性,这可能与其出入场地沙门菌污染严重程度有关。根据本研究结果,应加强对腹泻猪只和经产猪只圈舍的消毒,适当增加消毒液中药物的有效浓度,增加消毒频率,在消毒过程中应加强对角落的消毒工作;产房应在一个围产期结束后对其环境进行全方位消毒,并且配怀舍也要加强消毒,改善待产母猪生活环境的卫生条件,降低待产母猪与沙门菌等病原菌的接触几率,从而降低待产母猪进入产房时的带菌率;同时工作人员要加强鞋底、手部等日常消毒。
3.2 猪场中环境源沙门菌耐药情况较人源和猪源更严重
抗菌药物耐药性在人、动物和环境层面的流动与循环,对人类、动物和环境的健康造成了巨大威胁[25]。本研究中3种来源沙门菌对四环素类和酰胺醇类药物的耐药率均在65.0%以上,在对四环素和多西环素表现为不耐药的菌株中分别检出了92.5%和55.6%处于中介状态的菌株,暗示养殖场近期如果使用上述药物会造成耐药沙门菌数量的快速增加。不同来源的沙门菌对喹诺酮类药物耐药率差异较大,环境源沙门菌对环丙沙星和恩诺沙星的耐药率均显著高于猪源沙门菌,而人源沙门菌对环丙沙星(64.7%)的耐药率接近于环境源沙门菌的耐药率,对恩诺沙星(11.8%)的耐药率接近于猪源沙门菌的耐药率。分析原因可能是环境中耐环丙沙星的沙门菌主要来自于饲养员,尤其是工人流动相对频繁的产房环境和保育猪环境中环丙沙星耐药菌株检出率更高也间接的证明这点。值得注意的是,本研究中腹泻猪源沙门菌对环丙沙星和恩诺沙星的耐药率是健康猪源沙门菌耐药率的6.5倍以上,但是腹泻猪源沙门菌对上述2种药物的中介率低于健康猪源沙门菌,出现这种耐药性差异可能是因为养殖场仅对腹泻猪只进行隔离治疗,导致腹泻猪只携带的中介耐药沙门菌快速转变为耐药菌。此外,该场沙门菌对头孢噻呋和亚胺培南敏感性较高,未检出对左氧氟沙星和阿米卡星耐药的菌株,因此上述药物可以作为治疗细菌性疾病的备选药物,但是在使用时也应注意使用剂量和用药周期,避免出现新型耐药菌株。
多药耐药结果显示,该场的沙门菌多药耐药集中在4耐(26.0%)和7耐(34.0%),耐药谱型种类多达30种。由于健康状况和饲养环境的不同,腹泻猪源沙门菌多药耐药率(81.3%)高于健康猪源沙门菌多药耐药率(68.6%),与酒跃光等[26]报道的结果相似。在环境源沙门菌中,产房环境源和保育猪环境源沙门菌的多药耐药率均为100.0%;通过对比发现,工人鞋底源、产房环境源和保育猪环境源沙门菌多药耐药谱种类较为单一,且均以GEN-TET-DOX-CIP-ENO-FFC-AMP 7耐谱型为主,分析可能是因为工人频繁进出产房和保育猪圈舍,加剧了耐药菌在二者之间的传播。
3.3 猪场中环境源沙门菌耐药基因检出情况较人源和猪源更严重
细菌可以通过可移动元件的水平转移获得抗菌药物的耐药基因,并且会造成耐药基因在人、动物和环境中流动循环[27-31]。本研究耐药基因结果显示,该场分离的沙门菌blaTEM基因的检出率高达100.0%,说明blaTEM基因是介导该场沙门菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要原因之一。本研究blaCTX-M基因检出结果与杨丹[32]和Wang等[33]一致,在7株检出blaCTX-M基因的猪源沙门菌中有6株来自腹泻猪粪样,并且其中2株还同时携带碳青霉烯类多药耐药基因blaNDM。blaNDM基因阳性菌株可以通过人和动物传播到环境中,目前在河水、污水、养殖场周围环境中都有检出blaNDM基因阳性菌株[34],该基因已经成为中国第二流行的碳青霉烯酶,并且产NDM酶的菌株大多同时携带多种耐药基因[35]。qnrS、oqxA和oqxB这3种质粒介导的喹诺酮类耐药基因在猪场不同来源沙门菌中的检出率有所差异,环境源和人源沙门菌以携带oqxA基因和oqxB基因为主,而猪源沙门菌以携带qnrS基因为主,耐药基因检测结果与耐药表型呈正相关。携带上述基因的细菌可以通过饲料、饮水、人员流动甚至空气进行传播,且在临床滥用药物的压力下,这些基因的表达可能会增强,菌株突变的频率会增大,导致敏感菌迅速发展为耐药菌,因此不容轻视[32,36]。该场中3种来源沙门菌携带的氨基糖苷类和氟苯尼考耐药基因分别以ant(3″)-Ia基因和floR基因为主,与对应抗菌药物的耐药表型基本一致。猪源沙门菌携带的四环素类耐药基因以tetA基因(50.7%)和tetM基因(49.3%)为主,推测猪源沙门菌对四环素和多西环素耐药主要是由tetA基因和tetM基因介导,而另外两种来源的沙门菌对四环素的耐药率超过85.0%,但tetA基因和tetM基因的检出率未超过10.0%,耐药表型与耐药基因型不相符,分析可能存在其他介导四环素类药物耐药的基因(如tetB、tetC和tetO等)或酶解蛋白[37]。由于耐药菌株和耐药基因会跨物种进行传播,所以,从人、动物和环境3个方面防控耐药菌株及耐药基因的流动尤为重要[34]。
我国大部分地区的养猪场都存在较为严重的耐药问题,细菌耐药监测是掌握细菌耐药性的重要措施,可以为临床使用抗菌药物提供数据支持,实验室与临床结合,遏制抗菌药物耐药,保护公共卫生安全。当前,我国正处于“减抗”时期,养猪场应该坚持饲喂生物饲料,多使用抗菌药物替代品防治疾病,如中兽药、生物兽药、微生态制剂和动物用免疫增强剂等,这些都可以有效控制动物源细菌耐药性,减少兽药残留,促进养猪业向好发展。同时,养猪场应该坚持科学、规范做好圈舍和用具消杀工作,这样能有效抑制病原菌的传播和生长,结合定期打扫圈舍卫生,可以减少带菌或发病猪只数量的增加。
新疆该猪场人源样品中沙门菌的检出率高于养殖环境和猪源样品中的检出率,环境源沙门菌的耐药情况和耐药基因检出情况较人源和猪源沙门菌更严重。在对猪只临床用药时推荐选取人、动物和环境3种来源沙门菌敏感性均比较高的药物治疗细菌性疾病,如头孢噻呋等。由于该猪场沙门菌多药耐药情况严重,耐药表型种类多,且耐药基因携带率高,为治疗和耐药菌防控增加难度,应从人-动物-环境健康的视角出发,结合沙门菌的分离和耐药性检测,同时规范消杀流程,合理使用抗菌药物,全面的对猪场中沙门菌进行持续监测,实验室与临床结合,共同促进人、动物和环境健康。
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