马银花，刘桃梅，万天雪，肖新波，胡琼，李萍芳，段仁燕，张斌，金晨钟，杜波
(1. 湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南娄底 417000；
2. 武汉大学生命科学学院/杂交水稻国家重点实验室，湖北武汉 430072)
类受体胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinases，RLCKs)是一类只含有胞内激酶结构域、无胞外信号肽结构域和跨膜结构域的特殊蛋白激酶家族，在植物的生长发育、病原菌防御、胁迫等过程中发挥着重要的生物学功能[1-4]。
研究表明这类蛋白在拟南芥中有200 个成员，水稻中有379 个成员，根据氨基酸序列的系统发育分支，RLCKs 在拟南芥中被分为13 个亚家族，在水稻中被划分为17 个亚家族[3-6]，其在植物中通过磷酸化下游靶蛋白发挥功能，主要参与了植物的生长、信号转导、非生物胁迫和生物胁迫应答等生理过程[7]。
其中研究最多的为RLCK Ⅶ亚家族在植物免疫中的作用，有关RLCK Ⅵ亚家族基因的研究很少。
对OsRLCK57、OsRLCK107、OsRLCK118和OsRLCK176功能特性进行的研究表明，其参与了XA21 介导的水稻先天免疫和BR 信号介导的水稻发育[8]；
OsRLCK102是RLCK Ⅶ亚族蛋白基因，同时受生物与非生物胁迫的诱导表达，参与了水稻的生长发育与免疫反应的调控[9，10]。
近些年，拟南芥中RLCK Ⅵ亚家族蛋白参与植物生长与病原体防御相继被报道，如Rop 结合蛋白激酶1 和2(RBK1 和2)直接结合AtRop4 GTPase，是植物生长和病原体防御中多种信号传导途径的重要调节子[11]；
Rop 相互作用类受体激酶1 和2(AtRRK1 和2)可以在体外被GTP 结合的Rop GTP 酶特异性激活[12]；
属于RLCK Ⅶ亚家族的BIK1 和PBL1 与细胞膜上的受体激酶FLS2和BAK1 相互作用，并且BIK1 和PBL1 在FLS2被其配体flg22 激活时迅速磷酸化，bik1和pbl1突变体在其FLS2 介导的免疫应答中表现出表型缺陷，表明BIK1 和PBL1 在FLS2 和BAK1 的相互作用介导的PTI 信号传导过程中具有重要作用[13，14]。
与拟南芥RLCK Ⅵ亚家族相比，对于水稻中RLCK Ⅵ亚家族基因的研究报道更为稀少。
Os-RRK1(对应编号为OsRLCK216)是一个与OsLec-RK 相互作用的蛋白，也是少有被报道过的水稻RLCK Ⅵ亚家族成员，研究发现OsRRK1 在叶片发育与稻飞虱抗性等方面发挥着重要作用；
Os-RRK1基因的过表达能使得水稻叶片卷曲，表明RLCK Ⅵ亚家族可能在水稻发育和免疫方面发挥作用[4，15-17]。
前期课题组在对OsRRK1基因与其他RLCK Ⅵ亚家族成员同源蛋白的系统发育分析研究中发现OsRLCK167与其同源性很高，同属于RLCK Ⅵ家族成员。
利用生物信息学分析可以研究蛋白质序列、结构以及功能，并对蛋白质进行同源分析，研究蛋白质之间的进化关系，揭示蛋白质家族间的关系[18-20]。
因此对OsRLCK167 蛋白的理化性质、蛋白结构等方面进行生物学信息学分析，可为深入研究其生物学特征提供一定理论基础；
通过荧光定量PCR 对OsRLCK167进行组织表达模式分析，推测其在水稻叶片生长发育过程中可能发挥的作用能进一步丰富对水稻RLCK Ⅵ亚家族基因功能的研究，深化对该家族基因的认识，以期为深入探究水稻RLCK Ⅵ亚家族蛋白在水稻中的生物学功能和挖掘水稻抗性新基因提供一定的理论基础。
1.1 试验材料
粳稻品种Hejiang 19(H1493)购自国家种质资源库，用于提取水稻RNA；
OsRRK1和OsRLCK167的ORF 序列；
Escherichia coli菌株TOP10为武汉大学杂交水稻国家重点实验室何光存教授课题组提供。
1.2 生物学信息分析
运用ExPASy-Protparam、Protscale、NCBI 网站的CD-search、SOPMA、Phyre 和Psort 等在线工具对OsRLCK167 蛋白的理化性质、二级结构、三级结构和亚细胞定位进行生物信息学预测与分析。
1.3 同源基因序列比对与进化树分析
通过DNAMAN 软件将OsRLCK167基因与OsRRK1基因进行序列比对，再用MEGA 5.10 对OsRLCK167 蛋白、水稻中与OsRLCK167 相似性较高的5 个RLCK 和拟南芥RLCK ⅥA 家族的7个成员构建系统发育进化树。
1.4 组织表达模式分析
采用TRIzol 试剂(Invitrogen， USA)提取粳稻品种Hejiang 19(H1493)的幼芽、幼根、二分蘖期的根、二分蘖期的叶、成熟期的剑叶、倒二叶、茎、叶鞘、幼穗等组织mRNA；
RNA 的反转录按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)
的操作步骤进行；
用Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物qRT-OsRLCK167f:5＇-CCTCGTCCTTCCCTCTCGTG-3＇和qRT-OsRLCK167r:5＇-CTGCTGCTGCTGTCTGTCTC-3＇；
以反转录产物为模板，以水稻Actin基因为内参，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析OsRLCK167在不同组织中的表达模式，每个样品3 次重复。
PCR 反应体系:DNase/RNase-Free ddH2O(TIANGEN) 2.9 μL，2×Super mix 4 μL，上、下游引物(5 mmol/L)各0.3 μL，cDNA 模板0.5 μL。
反应程序:95℃变性2 min；
95℃变性5 s；
60℃退火20 s，共40 个循环。
2.1 OsRLCK167 蛋白的生物信息学分析
2.1.1 OsRLCK167 蛋白的理化性质分析OsRLCK167基因编码含有391 个氨基酸的蛋白质，通过ExPASy-Protparam 在线工具对OsRLCK167 蛋白的理化性质进行分析，结果显示该蛋白分子式为C1920H2951N547O600S15；
相对分子量为43.77776 kD；
理论等电点为4.87；
富含强碱性氨基酸(Arg、Lys 共42 个)和强酸性氨基酸(Asp、Glu 共67个)，蛋白质不稳定指数为47.35，为不稳定蛋白，脂肪系数为77.83。
氨基酸组成分析结果表明，天冬氨酸(Asp)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)所占比例较高，分别为10.0%、9.7%、7.7%、7.7%、7.4%、7.4%、7.2%，甲硫氨酸(Met)和谷氨酰胺(Gln)占比较低，分别为1.5%和1.8%(表1)。
OsRLCK167 蛋白的亲水性预测表明，OsRLCK167 蛋白的氨基酸组成中大多为疏水性氨基酸，因此该蛋白为疏水性蛋白(图1)。
综上，OsRLCK167 蛋白是一个疏水性的、不稳定的酸性蛋白。
图1 OsRLCK167 蛋白的疏水性/亲水性预测分析
表1 OsRLCK167 蛋白的氨基酸含量
2.1.2 OsRLCK167 蛋白保守功能域的预测 通过NCBI 网站的CD-search 工具对OsRLCK167 蛋白的保守功能域进行预测，OsRLCK167 蛋白特定匹配(specific hits)在SPS1，非特定匹配(non-specific)在STKc_IRAK(图2)，因此，OsRLCK167 蛋白属于PKc_like superfamily(RKc_like 超级家族)。
图2 OsRLCK167 蛋白的保守功能域
2.1.3 OsRLCK167 蛋白的二级结构预测 通过在线网站SOPMA 预测OsRLCK167 蛋白的二级结构，结果表明，OsRLCK167 蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(random coil 41.94%)、α-螺旋(alpha helix 35.29%)、延伸链(extended strand 15.35%)和β-转角(beta turn 7.42%)组成(图3)。
因此，该蛋白晶体的空间构象可能以无规则卷曲结构为基础所构成的。
图3 OsRLCK167 蛋白的二级结构预测
2.1.4 OsRLCK167 蛋白的三级结构预测 通过在线软件Phyre 对OsRLCK167 蛋白三级结构模型进行预测分析表明，该蛋白由α-螺旋(alpha helix)、β-转角(beta turn)和无规则卷曲(random coil)连接而成(图4)。
图4 OsRLCK167 蛋白的三级结构预测
2.1.5 OsRLCK167 蛋白的亚细胞定位 通过在线网站Psort 进行预测分析表明，该蛋白最可能定位于细胞质，这与OsRRK1 蛋白的亚细胞定位在细胞质的结果一致[16]，其次可能定位于线粒体、细胞核和内质网，定位于分泌系统囊泡和液泡的可能性较低(表2)。
表2 OsRLCK167 蛋白的亚细胞定位
2.2 OsRLCK167 同源基因序列比对与进化分析
对OsRRK1及同源基因OsRLCK167序列进行比对分析发现，OsRRK1的ORF 序列为1179 bp，OsRLCK167的ORF 序列是1176 bp，两者长度接近。OsRLCK167含有6 个外显子、5 个内含子。用DNAMAN 软件将两者的ORF 序列进行比对，两者的一致性达70.06%(图5)。
图5 水稻OsRRK1 与OsRLCK167 的序列比对
将OsRLCK167 蛋白、水稻中与OsRLCK167相似性较高的5 个RLCK 和拟南芥RLCK ⅥA 家族的7 个成员做亲缘关系分析发现，OsRRK1 与RLCK ⅥA 亚家族亲缘关系最近；
进化树分析结果表明，OsRLCK167 属于RLCK ⅥA 亚家族成员，并且与水稻中的OsRRK1 同源性最高(图6)。
图6 OsRRK1 与拟南芥和水稻中其他RLCK 家族的进化分析
2.3 OsRLCK167 基因的组织表达模式分析
由图7 可知，OsRLCK167基因在叶鞘中的表达量最高，其次是在剑叶和倒二叶中；
在幼芽、幼根、二分蘖期的根中表达量很低；
二分蘖期的叶、茎和幼穗中表达量较低。OsRRK1基因在所检测的组织中都有表达，是一个组成性表达基因；
Os-RRK1基因在水稻生长发育的各个时期都有表达，在叶片中的表达量较高，在抽穗期的剑叶中表达量最高[17]。
通过对比分析表明，OsRRK1和Os-RLCK167并非同一基因，在不同组织中表达量存在一定差异；
另一方面，OsRRK1和OsRLCK167是同源基因，且在水稻生长发育的各个时期都有表达，但组织表达模式完全不同，这暗示两个基因虽然结构上相似，但基因功能可能不同。
图7 OsRLCK167 基因在水稻不同组织中的表达量
RLCK 家族基因存在多种植物中，并在植物生长、发育、防御等方面起着重要作用。
采用生物信息学方法进行分析，约60%的水稻RLCK基因序列中含有至少5 个内含子，379 个水稻RLCK基因的内含子数目从0 到26 个不等，约70%左右的RLCK 蛋白序列中只含有1 个蛋白激酶结构域，且参与许多重要的生理过程[3，7，11，21，22]。
而OsRLCK167 蛋白属于RLCK ⅥA 亚家族成员，并且与水稻中的OsRRK1 同源性最高，从基因序列对比来看，OsRLCK167与OsRRK1序列长度十分接近，一致性达到70.06%，且OsRLCK167基因在根、茎、叶、叶鞘等均有表达，说明OsRLCK167基因可能与OsRRK1基因一样参与多个组织器官的发育过程。
前期研究已发现OsRRK1 与水稻植株叶片直立有关，OsRLCK167 也与水稻叶片生长发育相关，其在水稻生长发育中的功能可能与OsRRK1相似，但基因功能可能不同；
将OsRRK1抑制表达的转基因植株与野生植株对比，没有产生显著的表型差异，且发现其同源基因OsRLCK167在Os-RRK1抑制表达转基因植物中的表达量与野生型相比并无差异。
据此我们推测，抑制OsRRK1基因的表达并不影响水稻叶发育表型的原因可能是OsRRK1基因与同源基因OsRLCK167存在功能冗余关系。
本研究表明，OsRLCK167 是一个具有疏水性、保守的、酸性、不稳定蛋白，以高水平、保守方式调控水稻多个生物学过程，且与同源基因Os-RRK1在组织表达模式上相似。
本研究进一步丰富了对RLCK Ⅵ亚家族基因的研究，为后续深入研究OsRLCK167 蛋白的不同生理功能提供了理论基础。
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