林而舒
(福建省淡水水产研究所，福州 350000)
鳗鲡(Anguillaapp.)是我国淡水养殖的重要经济品种，因其具有营养丰富、肉质鲜美等特点，深受消费者喜爱[1]。但是随着集约化养殖模式的不断发展，鳗鲡养殖过程中的病害种类越来越多，危害也日趋严重。其中以鳗鲡病毒性疾病危害特别严重，具有发病急、病程短和死亡率高等特点，给养鳗业带来了巨大的经济损失[2]。鳗鲡病毒性病原主要包括：鳗鲡疱疹病毒(Anguillidherpesvirus)[3]、鳗鲡圆环病毒(Eelcircovirus，EeCV)[4]、鳗鲡双RNA病毒(Eelviruseuropean)[5]等。
EeCV是引起鳗鲡圆环病毒病的主要病原，患病病鳗呈现红头、烂鳃后“开窗”、喉部囊肿等症状。EeCV为小型的、裸露的环状单链DNA病毒，其结构为二十面体病毒粒子，直径大小为12～26 nm，衣壳仅由1种结构蛋白(衣壳蛋白)组成。EeCV基因组大小在1.7～2.3 kb之间[6，7]，有一个双义的基因组，包含两个主要的开放阅读框(ORF)，以相反的方向排列，编码复制启动蛋白和衣壳蛋白。在主要ORF的5′端之间有一个非常保守的茎环结构位，在病毒复制中起着重要作用[7]。在过去的研究中，只有禽类和猪被认为是圆环病毒的常见宿主，但近几年随着检测技术的不断进步，发现圆环病毒的脊椎动物宿主谱已经扩大至鱼类和两栖动物[8-11]。
国内外关于EeCV的研究均处于起步阶段[12，13]，关于EeCV检测方法的报道则更少，李苗苗[4]在2018年报道过EeCV PCR检测方法的建立与应用，BORZK等[12]利用巢式PCR技术对EeCV进行检测。本研究设计了多对qPCR引物，筛选出一对能够高效且特异扩增EeCV复制相关蛋白基因(replication-associated protein，RAP)部分序列的引物，基于该基因序列建立了EeCV SYBR Green I qPCR检测方法，以期为准确、快速地定量检测鳗鲡圆环病毒提供新的技术手段。
1.1 实验材料
具有鳗鲡圆环病毒病典型特征的患病鱼取自福建省大田、邵武、福清、光泽和江西武宁、吉安等地区的鳗鲡养殖场。将病鳗装在塑料袋中充氧，2～3 h内运达实验室，迅速活杀，取病鱼的血液、粘液、鳃、心、肝、脾、肠、肾组织等保存于-20 ℃冰箱备用。
1.2 主要试剂
Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion2.0plus dye)试剂盒、TBGreen®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒和质粒抽提试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司；
海洋动物基因组DNA提取试剂盒、血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；
ONE-4-ALL基因组DNA小量提取试剂盒和MightyScript第一链cDNA合成Master Mix试剂盒购于BBI生命科学有限公司；
pUCm-T载体PCR产物快速连接试剂盒、DNA Marker、DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。猪圆环病毒(Porcinecircovirus)FN毒株DNA由福建农林大学动科院馈赠，鸭圆环病毒(Duckcircovirus)FJ毒株DNA由福建省农科院馈赠，鳗鲡疱疹病毒(Anguillidherpesvirus)AnHV毒株DNA和罗非鱼湖病毒(Tilapia lake virus)TiLV毒株RNA由福建省水产技术推广总站馈赠，维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)、迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)和鳗鲡(Anguillajaponica)基因组由实验室自行分离提取，-80 ℃保存。
1.3 主要仪器
普通PCR仪(T100TMThermal Cycler，BIO-RAD)、qPCR仪(7500 Real Time PCR System，ABI)、超微量紫外可见分光光度计(BioDrop μlite+，BioDrop)、凝胶成像分析系统(Gel DocTM XR+，BIO-RAD)等。
1.4 引物设计与合成
根据GenBank中鳗鲡圆环病毒参考株(KU951579.1)的基因组序列设计特异性扩增RAP序列的普通PCR引物对RAP-F/R，并在此基础上设计优选SYBR Green I qPCR引物对qF/R(表1)。Lmm-F/R参考文献[4]。
表1 引物列表Tab.1 Primer list
1.5 质粒标准品的制备
取肝、肾、脾和鳃等混合组织病料20 mg，使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。用引物RAP-F/RAP-R对总DNA进行PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收纯化目的片段后，由上海生工公司进行测序验证。
将目的片段克隆至pUCm-T载体，用质粒抽提试剂盒提取质粒DNA后，进行测序鉴定，获得质粒pUCm-T-RAP，于-80 ℃保存备用；
用超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度，并计算单位体积(μL)DNA样品中质粒的拷贝数，计算方式参考文献[2]。
1.6 qPCR检测方法的建立
1.6.1 建立标准曲线
10倍比稀释质粒pUCm-T-RAP DNA至1.0×108～100个拷贝数/μL作为模板，共计9个浓度梯度。使用TBGreen®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行qPCR扩增，引物为qF/qR，每个浓度设置3个重复，阴性对照用ddH2O代替模板，制作标准曲线。qPCR反应体系总量为20 μL：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Dye II 0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。扩增条件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。
1.6.2 灵敏性检测
将pUCm-T-RAP质粒DNA梯度稀释作为模板，分别进行qPCR和普通PCR扩增，qPCR方法使用的引物为qF/qR，普通PCR法使用的引物为Lmm-F/R，以便分析2种方法所能检测的最低EeCV拷贝数。
普通PCR反应体系总量为20 μL：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；
72 ℃再延伸10 min。
1.6.3 特异性检测
将鳗鲡疱疹病毒、猪圆环病毒、鸭圆环病毒、罗非鱼湖病毒、鳗鲡、迟钝爱德华菌和维氏气单胞菌的基因组作为模板进行qPCR扩增，评价检测方法的特异性。其中罗非鱼鱼湖病毒为RNA病毒，需将RNA反转录为cDNA再进行qPCR，反转录体系总量为20 μL：2×Mix 10 μL，模板6 μL，ddH2O 4 μL；
反转录程序为：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。
1.6.4 重复性检测
取1.0×106、1.0×105、1.0×104个拷贝数/μL的pUCm-T-RAP质粒DNA和临床样品作为模板进行qPCR扩增，每个浓度设3个重复，根据阈值循环数(Cycle threshold value，Ct值)的变异系数分析该方法的组内重复性；
实验重复3次，分析组间重复性。
1.7 qPCR检测方法在临床样品的应用
选取8尾患圆环病毒病的美洲鳗鲡，分别收集其皮肤黏液、鳍、鳃、肝脏、肾脏、脾脏、肠道和心脏等重要组织，用海洋动物基因组DNA提取试剂盒总DNA作为模板，用建立的qPCR方法分别检测不同病鳗不同组织部位的圆环病毒载量，分析病毒在不同组织的分布状况。实验数据使用Excel进行统计和整理，用DPS数据处理系统进行差异显著性分析。
用建立的qPCR方法和普通PCR法对44份疑似感染鳗鲡圆环病毒的鳗鲡组织样品进行检测。qPCR方法使用的引物为qF/qR，普通PCR法使用的引物为Lmm-F/R，比较两种方法的检出率。检测实验重复3次，并各抽取5份阳性检测产物送往上海生工测序，其中qPCR阳性产物需先克隆至pUCm-T载体再进行测序。
2.1 标准质粒的构建
从感染鳗鲡圆环病毒的病料中提取总DNA作为模板，用引物对RAP-F/R进行扩增，得到861 bp的片段(图1)。经测序分析显示，扩增获得的EeCV-RAP与GenBank中的EeCV参考株(KU951579.1)replication-associated protein的序列完全一致。进一步将该片段克隆至载体，经单酶切和测序鉴定，获得重组质粒pUCm-T-RAP。
图1 EeCV RAP的PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of EeCV RAPM：DL2000 DNA marker，1：EeCV-RAP，2：阴性对照。
2.2 EeCV SYBR Green I qPCR 标准曲线的建立
10倍比稀释质粒pUCm-T-RAP DNA至为1.0×108～102拷贝数/μL作为模板，进行qPCR扩增，绘制Ct值与质粒拷贝数的lg对数之间的标准曲线。Ct值与质粒拷贝数的lg对数的线性关系为y=-2.853 6x+31.999，相关系数R2为0.995 1(图2)，表明该qPCR方法的Ct值与1.0×108～102拷贝数/μL标准质粒有较好的线性关系。1.0×108～102/μL标准质粒的熔解曲线均只有一个熔解峰，熔解温度区间为82.24～83.15 ℃(图3)，表明qPCR反应产物均为圆环病毒的特异性扩增产物，并无非特异性扩增或引物二聚体产生。
图2 EeCV SYBR Green I qPCR检测的标准曲线Fig.2 Standard curve plot of the EeCV SYBR Green I qPCR assay
图3 EeCV SYBR Green I qPCR检测的熔解曲线Fig.3 Metting curve of the EeCV SYBR Green I qPCR assay
2.3 EeCV SYBR Green I qPCR的灵敏性、特异性和重复性检测
将pUCm-T-RAP梯度稀释至1.0×108～100拷贝数/μL作为模板，分别进行SYBR Green I qPCR和普通PCR扩增。结果显示，普通PCR的最低检出拷贝数为1 000拷贝数/μL(图4a)，1.0×102～100拷贝数/μL无法扩增；
而SYBR Green I qPCR的最低检出拷贝数可达100拷贝数/μL，1.0×101～100拷贝数/μL无法扩增(图4b)；
SYBR Green I qPCR法比普通PCR法的灵敏性高10倍。
图4 普通PCR和SYBR Green I qPCR检测灵敏度Fig.4 Sensitivity of conventional PCR assay and SYBR Green I qPCR assay in detection of EeCVa：EeCV普通PCR的检测灵敏性，M：DL2000 DNA marker，1～9：108～100个拷贝的重组质粒，10：阴性对照；
b：EeCV SYBR Green I qPCR的检测灵敏性，1～9：108～100个拷贝的重组质粒，10：阴性对照。
以鳗鲡疱疹病毒、猪圆环病毒、鸭圆环病毒、罗非鱼湖病毒、鳗鲡、迟钝爱德华菌和维氏气单胞菌的基因组和pUCm-T-RAP为模板，进行SYBR Green I qPCR扩增的特异性检测。pUCm-T-RAP有扩增曲线产生，而鳗鲡疱疹病毒、猪圆环病毒、鸭圆环病毒、罗非鱼病毒和阴性对照均无扩增信号(图5)，表明SYBR Green I qPCR扩增法具有良好的特异性。
图5 EeCV SYBR Green I qPCR检测特异性Fig.5 Detection specificity of the EeCV SYBR Green I qPCR assay1：EeCV，2：Anguillid herpesvirus，3：Duck circovirus，4：Tilapia lake virus，5：Porcine circovirus，6：Anguilla japonica，7：Edwardsiella tarda，8：Aeromonas veronii，9：阴性对照。
取3个不同浓度的pUCm-T-RAP标准品(1.0×106、1.0×105、1.0×104个拷贝数/μL)和1个临床样品作为模板进行qPCR扩增，检测SYBR Green I qPCR方法的重复性。组内变异系数和组间变异系数均小于3%，组内变异系数分别为2.24%、1.66%、2.82%和0.41%；
组间变异系数分别为2.66%、2.01%、2.39%和1.59%(表2)，表明SYBR Green I qPCR方法的检测结果具有稳定性和可靠性，重复效果好。
表2 EeCV SYBR Green I qPCR的重复性Tab.2 Detection repeatability of the EeCV SYBR Green I qPCR
2.4 EeCV SYBR Green I qPCR方法的应用
用建立的EeCV SYBR Green I qPCR方法检测感染圆环病毒的鳗鲡体内不同组织的病毒载量差异，结果显示，在鳗鲡的肝脏、皮肤黏液、肾脏、鳍、脾脏、肠道、心脏和鳃均可检测到EeCV，并且在鳃部的EeCV含量显著高于其他组织(图6)。
图6 EeCV感染鳗鲡主要组织内EeCV的分布情况Fig.6 Distribution of EeCV in the primary tissues of eels infected with EeCV1：肝脏，2：皮肤黏液，3：肾脏，4：鳍，5：脾脏，6：肠道，7：心脏，8：鳃。
用普通PCR法和建立的EeCV SYBR Green I qPCR方法对实验室收集的44份疑似鳗鲡病毒感染病料进行检测。结果显示，普通PCR法共检出32份阳性样品，阳性检出率为73%；
而SYBR Green I qPCR法检出43份阳性样品，阳性检出率为98%。实验重复3次，结果均一致，PCR法检出的样品，qPCR法都能检出。并各抽取5份阳性检测产物进行测序分析，其中qPCR阳性产物需先克隆至pUCm-T载体再进行测序。测序结果确为EeCV基因序列，排除假阳性干扰，表明SYBR Green I qPCR法比普通PCR法更为灵敏。
圆环病毒最开始是从猪和鹦鹉体内检测到的[14，15]，后来随着检测技术的不断进步，从低脊椎动物和无脊椎动物中也发现大量和圆环病毒的相关序列[10，12，16]。ANDOR等[13]在2014年从欧洲鳗鲡身上分离得到的了一株新型圆环病毒，并进行全基因组测序，其临床病变特征为头部区域出现乳头状肿瘤。其实欧洲鳗鲡的这种病变早在20世纪初的北欧河流的支流地区就已经出现过[17]。目前国内养殖的鳗鲡品种感染圆环病毒的临床症状与上述欧洲鳗鲡的临床症状不尽相同，其临床症状主要表现为烂鳃后“开窗”、红头、喉部囊肿，发病症状酷似鳗鲡疱疹病毒感染出现的脱黏、败血、红头等现象[18]。
由于过往对鳗鲡圆环病毒病认识不深且诊断技术较为落后，该病毒性疾病未能被准确诊断，也未能引起重视，但近几年随着诊断技术的不断提升，鳗鲡圆环病毒的检出阳性率似乎在逐渐提高，如李苗苗[4]2018年在160份福建省鳗鲡样品中阳性检出率就高达40.6%。这也说明圆环病毒可能比之前预想的要广泛存在。因此建立高效、准确的检测手段对防控鳗鲡圆环病毒病有重要意义。SYBR Green I qPCR检测方法广泛应用于病原检测，目前圆环科中的鸽圆环病毒(Pigeoncircovirus)[19]、猪圆环病毒[20]、鸭圆环病毒[21]和犬圆环病毒(Caninecircovirus)[22]都已建立SYBR Green I qPCR方法，其中猪圆环病毒不仅1型[20]、2型[23]、3型[24]和4型[25]都分别建立了荧光定量PCR检测法，甚至还拓展出了双重荧光定量PCR法[26]和三重荧光定量PCR法[27]，大大提升了猪圆环病毒的阳性检出率。
而鳗鲡圆环病毒目前仅建立了普通PCR检测法，还存在无法准确定量、低拷贝病毒无法准确检测等缺点[19]。为解决上述问题，本研究基于SYBR Green I qPCR检测方法的快速、准确、操作简单和易于实现的特点[2]，建立了EeCV SYBR Green I qPCR检测方法。在该方法中，其标准曲线的相关系数可达0.995 1，线性范围广(1.0×108～102拷贝数/μL)，这与其它类别圆环病毒构建的荧光定量法线性范围类似，如猪圆环病毒4型检测下限为5.64×102copies/μL[25]，犬圆环病毒的Ct值与标准品在6.18×109～6.18×102copise/μL范围内呈良好的线性关系[22]；
重复性好，组内和组间变异系数都小于3%；
灵敏性高，是普通PCR法的10倍，在临床应用上的结果也表明qPCR方法对疑似EeCV样品的阳性检出率远高于普通PCR法；
特异性强，与其近缘DNA病毒(猪圆环病毒、鸭圆环病毒)无交叉扩增，和鳗鲡其它常见病毒(鳗鲡疱疹病毒)也无交叉扩增；
在感染EeCV的鳗鲡重要组织中，鳃的病毒量显著高于其他组织(P<0.05)，与鳗鲡圆环病毒病会出现烂鳃的主要临床特征相吻合；
对保存的44份疑似鳗鲡病毒性感染病料进行检测，阳性检出率为98%，也表明了该检测方法具有较好的实际应用效果。其它病毒建立的荧光定量方法也存在临床样品阳性检出率高于普通PCR的情况，鸽圆环病毒荧光定量PCR方法对临床样品阳性率达75.7%，高于常规PCR方法的检测阳性率(54.1%)[19]；
鸭圆环病毒实时荧光定量PCR方法检出率为26.4%，明显优于常规PCR检测结果15.3%[21]。
综上所述，EeCV SYBR Green I qPCR为准确、快速地定量检测临床样品中的EeCV提供了新方法，可应用于EeCV病的诊断和流行病学研究。
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