范成平，白茂军*，田玉琴，昝建朋，董延鑫，杨 索，王 莹，陈 汶，杨小龙，李先伟，高正锋，徐 丝
（1.贵州省烟草公司 安顺市公司，贵州 安顺 561000；
2.云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201）
烤烟是我国的重要经济作物。近年来，频繁发生的土传病害造成了烤烟产量和质量的严重下降，严重威胁了我国烤烟的生产安全［1］。烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害，在我国福建、四川、贵州等省份的植烟区暴发流行，每年造成的经济损失在1000万元以上［2］。目前，烟草青枯病的主要防治手段有生物防治［3-4］、化学防治［5-6］、农业防治等［7］，但防治效果均不理想，例如：生物防治存在防治效果缓慢、适用范围有限、容易受环境影响等问题；
化学防治存在容易造成环境污染、农药残留等问题；
农业防治存在防治周期长、成本高等问题［8-9］。根际土壤微生物是土壤微生态系统最重要的组成部分，根系分泌物是根际土壤微生物的主要营养来源［10］，根系分泌物可以为微生物的生长提供碳源和氮源。酚酸类物质是根系分泌物中最主要的功能性物质，其对植物的自毒作用也是导致连作障碍的重要因素［11］。有研究表明，烟草根系分泌物中的某些低分子有机酸如肉桂酸、苯甲酸等能够通过降低土壤pH值促进土壤真菌的生长和繁殖，起到调节土壤真菌群体结构的作用，并间接影响土壤的理化特性［12-13］。刘艳霞等［14］研究发现，烟草根系分泌物中的苯甲酸和3-苯丙酸能同时促进土壤中病原菌和拮抗菌的生长繁殖，但对病原菌的促进作用显著强于拮抗菌，是造成长期连作烟草青枯病严重发生的重要诱因。另外，土壤养分失衡［15-16］也加剧了土传病害暴发的概率［17］，造成植物生长不良、抗病性降低［18］。因此，土壤酚酸类物质和营养元素会直接影响植物病害的发生，也会通过改变土壤微生物群落的组成间接影响植物病害的发生和发展［19-20］。迄今有关根际土壤中酚酸类物质以及其他土壤因子对烟草青枯病发生的影响研究较少。鉴于此，笔者通过田间调查，收集青枯病不同发病程度的烟株根际土壤，测定土壤酚酸含量、理化性质指标以及细菌、真菌的群落结构，探究了根际土壤环境因子对烟草青枯病发生的影响，旨在为烟草青枯病的科学防控提供理论依据。
1.1 试验地概况
土壤取样地位于贵州省安顺市紫云县大田坝村（106°18′19″E，25°34′40″N，海拔1044 m)。取样区域为同一地块，其土壤质地为砂质土，且肥力均匀、地块平整。试验地的基础理化性质：pH值为5.21，有机质24.28 g/kg，全氮1.42 g/kg，碱解氮162.74 mg/kg，硝态氮19.18 mg/kg，铵态氮9.74 mg/kg，全磷0.03%，速效磷3.33 mg/kg，全钾0.15%，速效钾54.08 mg/kg。种植的烟草品种为云烟87。
1.2 样品采集与制备
参照烟草病虫害分级及调查方法［21］，将烟株按照发病程度进行划分，即：健康烟株 （HTP），全株无病；
中度发病烟株（MDQ），茎部病斑超过茎围的1/2，或半数以上叶片出现轻度凋萎及少数叶片出现病斑；
重度发病烟株（SDQ），茎部病斑环绕茎围，或2/3以上叶片出现凋萎。
通过田间系统调查确定青枯病发病地块后，在旺长期对不同青枯病发病程度的烟株根际土壤进行取样，对相同发病程度的烟株取3株以上，采用抖根法收集根际0~2 mm的土壤，充分混匀后装袋，一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于提取土壤DNA，另一部分贮存在4 ℃冰箱，用于测定土壤养分含量。
1.3 土壤理化性状及酚酸类物质的测定
采用电位法测定土壤的pH值。土壤中碱解氮、硝态氮、铵态氮、速效磷、速效钾和有机质含量的测定分别采用碱解扩散法、紫外分光光度法、可见分光光度法、0.05 mol/L HCl-0.025 mol/L（1/2H2SO4）法、NH4OAc浸提—火焰光度计测定法、重铬酸钾容量法—稀释热法。
土壤酚酸类化合物的测定采用高效液相(HPLC)法。首先对土壤进行前处理，称取土样20.0 g，置于50 mL离心管（3次重复），加入20 mL 1 mol/L NaOH后静置24 h；
然后在室温下以200 r/min的转速振荡60 min，配平后离心20 min；
然后用12 mol/L盐酸将滤液酸化至pH值=2.5，2 h后离心除去胡敏酸，用1∶1的乙酸乙酯萃取3次；
在50 ℃条件下旋转蒸发，用纯净水溶解后，定容至2 mL，将其过0.22 μm的纤维膜，滤液用高效液相色谱测定。仪器为Aglient1200高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent (4.6 mm×250 mm)，流速为1 mL/min，柱温为25 ℃，采用全波长扫描法找到所测酚酸的最佳波长。流动相C（乙腈）和流动相D（0.3%磷酸水溶液）的梯度如下：0 min，流动相C 5%，流动相D 95%；
3 min，流动相C 5%，流动相D 95%；
14 min，流动相C 35%，流动相D 65%；
18 min，流动相C 40%，流动相D 60%；
20 min，流动相C 70%，流动相D 30%；
20 min，流动相C 90%，流动相D 10%；
25 min，流动相C 90%，流动相D 10%；
25 min，流动相C 5%，流动相D 95%；
30 min，流动相C 5%，流动相D 95%。标准样品为邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、香兰素、对香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水杨酸，进样量为10 μL。
1.4 土壤微生物的测定
土壤细菌：采用Illumina Hiseq测序方法对土壤细菌的丰度和结构进行评价。采用引物341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)对16S DNA 中V3～V4区域进行扩增，检测细菌的群落结构与多样性。使用TruSeq®DNA PCR-free Sample Preparation Kit试剂盒将纯化的PCR产物进行文库构建。经过Qubit和Q-PCR验证文库合格后，使用NovaSeq 6000对DNA文库进行测序。通过Qiime V1.9.1去除测序数据中平均质量分数低(Q＜20)及长度短（＜100 bp）的低质量序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。利用Uparse对所有样本的全部Effective Tags进行聚类，默认以97%的一致性序列聚类成为OTUs。进一步用Qiime V1.9.1中的BLAST方法与Unit (v7.2)数据库对OTUs序列进行物种注释，获得不同分类水平下微生物的丰度数据。
土壤真菌：使用MN NucleoSpin soil Kit (Machery-nagel，Dueren，Germany)从0.75 g土壤中提取总DNA。根据真菌的ITS1保守区使用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）进行扩增。扩增体系为50 μL：10×Buffer KOD 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、Index Primer（10 μmol/L)1 μL、Universal PCR Primer（10 μmol/L)1 μL、KOD酶1 μL、Template（100 ng/μL)1 μL，用ddH2O补至50 μL。对每个样品进行重复扩增、合并，然后使用Cycle Pure Kit(Omega，Norcross，GA，USA)进行纯化，形成测序文库，最后使用Illumina HiSeq 2500技术进行测序分析。
1.5 数据处理
利用SPSS 22.0和Excel 2010软件对试验数据进行处理；
用LSD法进行差异显著性检验；
利用R语言进行插图绘制。
2.1 青枯病不同发病阶段烟株根际土壤理化性状差异分析
从表1可以看出，青枯病不同发病阶段烟株的土壤理化性状与健康烟株存在显著差异。具体来说，青枯病不同发病阶段烟株根际土壤的碱解氮、硝态氮和速效钾含量均高于健康烟株根际土壤的，其中土壤碱解氮和硝态氮含量随发病程度的加重而增加，且差异达到了显著水平；
土壤pH值和铵态氮含量在HTP和SDQ两个处理间差异显著，SDQ较HTP分别降低了8.38%和26.95%。
表1 健康烟株与不同患病程度烟株根际土壤的理化性状
选择差异显著的3个理化指标（有机质、碱解氮、硝态氮含量），结合OTUs数据矩阵进行冗余分析（RDA）。
2.2 青枯病不同发病阶段烟株根际土壤酚酸类物质差异分析
表2显示：邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、水杨酸这4种酚酸含量在健康和发病烟株根际土壤样品间没有显著差异；
香兰素、对香豆酸、阿魏酸、苯甲酸这4种酚酸含量在健康土壤样品(HTP)和中度发病土壤样品(MDQ)间均没有显著差异，而在HTP和重度发病土壤样品(SDQ)之间均存在显著差异，其中香兰素含量表现为SDQ＞HTP，而对香豆酸、阿魏酸、苯甲酸含量均表现为SDQ＜HTP。
表2 健康与患病烟株根际土壤的酚酸类物质含量 μg/g
选择含量差异显著的香兰素、对香豆酸、阿魏酸、苯甲酸这4种酚酸类物质，结合OTUs 数据矩阵进行冗余分析（RDA）。
2.3 健康与发病烟株根际土壤微生物群落多样性分析
2.3.1 根际土壤细菌和真菌的Alpha多样性 Ace指数和Chao1指数可以反映群落的物种丰富度，Shannon指数和Simpson指数可以综合反映群落的物种丰富度和均匀度。本研究结果（表3）表明，在不同土壤样品间细菌和真菌的上述4个多样性指数均无显著差异，但健康烟株根际土壤细菌的Shannon、Chao1、Ace指数均高于发病烟株根际土壤的；
健康与发病烟株根际土壤真菌的Shannon指数与Simpson指数相近，Ace、Chao1指数随发病程度加重有先下降后增加的变化趋势。
表3 烟株根际土壤微生物群落的Alpha多样性指数分析结果
2.3.2 健康与发病烟株根际土壤细菌和真菌的Beta多样性 健康与发病烟株根际土壤细菌和真菌的NMDS图如图1所示，细菌（图1A）和真菌（图1B）的stress值分别为0.002、0.011，均小于0.1，说明此模型能较准确地描述不同土壤样本间微生物群落结构的差异。中度发病（MDQ）与健康烟株（HTP）根际土壤样品间细菌群落结构的差异小于重度发病（SDQ）与HTP烟株根际土壤样品间的（图1A），而在HTP、MDQ和SDQ烟株根际土壤样品间真菌群落结构有较大的差异（图1B），说明组间样本的Beta多样性随发病程度增加而差异逐渐增大。
图1 健康与发病对烟株根际土壤微生物群落Beta多样性的影响
2.3.3 健康与发病烟株根际土壤微生物在门水平上的差异 对不同土壤样品的测序结果进行分析，在不同青枯病发病程度烟株根际土壤细菌中所占比例较高的门有变形菌门(Proteobacteria)、Patescibacteria、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)等。比较不同发病程度烟株根际土壤细菌门类的差异，变形菌门、放线菌门(Actinobacteria)等在发病土壤中的相对丰度高于健康土壤的，厚壁菌门、酸杆菌门(Acidobacteria)等在健康土壤中的相对丰度高于发病土壤的。随着发病程度的增加，Patescibacteria的相对丰度从11.63%增加至16.96%，厚壁菌门从13.27%降低至8.84%（图2A）。不同发病程度烟株根际土壤真菌的优势类群为子囊菌门(Ascomycota)、Anthophyta、毛霉门(Mucoromycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)，其中，子囊菌门的相对丰度表现为发病土壤＞健康土壤，而Anthophyta的相对丰度则表现为健康土壤＞发病土壤（图2B）。
图2 在门水平上不同发病程度烟株根际土壤微生物的物种分布
2.3.4 健康与发病烟株根际土壤微生物在属水平上的差异 按照物种丰度排名，筛选出前10名属水平的菌群。在健康土壤样品（HTP）的细菌中，芽孢杆菌属（Bacillus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和Bdellovibrio的相对丰度较高；
与HTP土壤样品相比，SDQ中上述几个属的相对丰度均有所降低（图3A）。与HTP样品相比，在MDQ的真菌中，被孢霉属（Mortierella）、毛霉属（Mucor）和Pseudaleuria的相对丰度均有所增加，而在SDQ中有所下降；
Gongronella的相对丰度在MDQ中下降，而在SDQ中增加（图3B）。
图3 在属水平上不同发病程度烟株根际土壤微生物的物种分布
2.3.5 微生物群落组成与土壤环境因子的相关性 从图4A可以看出：2个排序轴解释了95.88%的土壤细菌菌群变化，其中CCA1解释了84.49%，CCA2解释了11.39%；
健康烟株和中度发病烟株根际土壤样品主要分布在第三象限，重度发病烟株根际土壤样品主要分布在第二象限；
土壤硝态氮(NO-N)和碱解氮(AN)含量与横坐标正轴的夹角小于其他指标的，表明这2个指标与CCA1的相关性较强；
土壤苯甲酸和对香豆酸含量与纵坐标重合，表明这2个指标与CCA2的相关性很强；
从箭头分布来看，土壤香兰素、硝态氮和碱解氮含量与重度发病烟株根际土壤细菌菌群存在较强的正相关性。由图4B中的箭头长度可以看出：土壤苯甲酸和对香豆酸含量对根际土壤真菌菌群结构的影响较大；
Bdellovibrio和鞘氨醇单胞菌属与土壤阿魏酸、对香豆酸、苯甲酸含量呈正相关，与有机质(SOM)、NO-N和AN含量呈负相关；
毛霉属和Pseudaleuria与土壤阿魏酸、对香豆酸、苯甲酸含量呈正相关，与NO-N和AN含量呈负相关。
图4 土壤因子与微生物群落间CCA分析结果
良好的土壤环境可以为农作物的健康生长奠定基础，而土壤养分失衡、板结等是引发烟草青枯病的主要原因［22］。本研究发现，不同程度青枯病发病烟株根际土壤的碱解氮（AN）、硝态氮（NO-N）和速效钾（AK）含量均高于健康烟株根际土壤的，可能是因为不同发病阶段的根际土壤养分失衡，而部分养分富集会增加烟株的感病性［23］。有研究表明，施用不同形态的氮既可以为植物提供养分，又具有减轻烤烟青枯病发生的作用，其中硝酸盐的同化有助于青枯菌在根系的黏附、茎部的定殖以及毒性增强［24］。在本试验中，土壤硝态氮和碱解氮的含量与重度发病烟株根际土壤细菌菌群存在较强的正相关性，可能是因为发病烟株根际土壤含有较多的硝态氮，而硝酸盐同化的增加导致发病程度加重。
作物根际土壤微生物会随着发病程度的变化而变化。黎妍妍等［25］的研究结果表明，青枯病发病烟株根际土壤细菌的多样性低于健康烟株根际土壤的，而土壤真菌的多样性会随着发病程度的加重而逐渐增加，这与本研究结果相似。在本研究中，中度发病土壤中真菌被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)和Pseudaleuria的相对丰度高于健康土壤的，这可能是因为Pseudaleuria属于子囊菌门(Ascomycota)中的小囊菌目(Microascales)，而小囊菌目中的真菌能够引发多种植物病害［26］。本研究还发现，土壤细菌群落中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和Bdellovibrio的相对丰度随着发病程度的增加而逐渐下降，这是因为鞘氨醇单胞菌属是土壤中的有益微生物［27］，它的减少可能导致病原微生物数量的增加。因此，推测烟株根际土壤中毛霉属与Pseudaleuria丰度的增加以及鞘氨醇单胞菌属丰度的降低可能是青枯病发生程度加重的关键微生物因素。
土传病害、根系分泌物及根茬残留腐解物的化感自毒作用被认为是引起作物连作障碍的主要因子，且根系分泌物是连作制度下土传病害发生的原初诱因［28］。根系分泌物对某些微生物具有吸引作用，这类具有趋化性的细菌或真菌能够在根际土壤中大量聚集和繁殖，比如豆科植物对根瘤菌的诱导；
而根系分泌物对某些病原菌具有抑制作用，比如小麦根系分泌物中的酚酸具有抗细菌的活性，并且其抗菌活性具有协同作用［14］。本研究结果表明：土壤香兰素含量与重度发病烟株根际土壤细菌与真菌菌群均存在较强的正相关性；
真菌中的毛霉属和Pseudaleuria，以及细菌中的Bdellovibrio和鞘氨醇单胞菌属与土壤阿魏酸、对香豆酸、苯甲酸含量均呈正相关。张克勤等［29］研究表明，阿魏酸和苯甲酸在根际土壤中存在强烈的自毒效应，其中阿魏酸是烟草根系分泌物中的主要酚酸，其分泌速率分别是对羟基苯甲酸和苯甲酸的12.2和38.5倍。通过适当提高土壤pH值来增加土壤自毒酚酸物质的分解速率，该方法能有效地防治烟草青枯病［30］。苯甲酸等能够通过降低土壤的pH值促进真菌的生长和繁殖，起到调节土壤真菌群体结构的作用，并间接影响土壤的理化特性［12］。但土壤微生物群落是一个复杂的群体，其微生物种类、数量以及相互作用关系受多方面因素的调节，单从根系分泌物上不能完整解释其动态变化的过程，尚需要结合土壤养分、水分及微生物间互作关系开展进一步研究。
烟株根际土壤酚酸类物质在患病与健康土壤中存在显著差异，患病烟株根际土壤细菌的多样性降低，真菌的多样性随青枯病发生程度的加重而先降低后增加，其中毛霉属和Pseudaleuria的相对丰度在中度发病土壤中增加，鞘氨醇单胞菌属的相对丰度在患病土壤中降低，均与土壤对香豆酸、阿魏酸、苯甲酸含量呈正相关。
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