景赞，吕雪梅，刘超
乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）
三聚氰胺，分子式是C3H6N6，IUPAC命名为1, 3,5-三嗪-2, 4, 6-三胺。它为白色的单斜晶体，几乎没有气味，常温下微溶于水[1]。三聚氰胺是重要的化工原料，可用于制造一种热固性树脂——三聚氰胺甲醛树脂，又称密胺树脂[2]，也可用于制造餐饮器皿。三聚氰胺对人身体有害[3-4]，不可用于食品加工或食物添加，曾被违法添加进乳制品中，造成对婴儿极大的危害[5-7]。以豆浆、椰汁为原料，探讨各种因素对三聚氰胺基质效应[8-10]的影响。
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）是将分离性能好的液相色谱串联专属、能提供相对分子量和结构信息的质谱法的一种快速、灵敏、准确的现代分析技术，被广泛用于定量分析复杂基质中的物质[11-16]，但LC-MS/MS检测中常存在基质效应，探讨基质效应的影响因素，并研究采用内标法[17-20]消除三聚氰胺的基质效应。
1.1 仪器与设备
高效液相色谱-质谱仪（AB-API4000，美国AB SCIEX公司）；
立式高速冷冻离心机（GL 20M，江苏新春兰科技仪器有限公司）；
电子天平（ME104E，梅特勒-托利多仪器有限公司）；
超纯水机[LKS01-40，科大环保科技（深圳）有限公司]；
氮吹仪（HSB-B，天津市恒奥科技发展有限公司）；
数控超声波清洗机（KQ700，昆山市超声仪器制造有限公司）；
固相萃取仪（VM24，天津艾杰尔科技有限公司）；
WCX前处理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]；
Cleanert PCX前处理小柱（60 mg/3 mL 天津艾杰尔科技有限公司）；
Bond Elut Plexa PCX前处理小柱（60 mg/3 mL安捷伦科技有限公司）。
1.2 材料与试剂
各类豆浆样品（来源于乐山当地不同摊位）；
椰树椰汁（椰树集团有限公司）；
特种兵生榨椰子汁（湛江市苏萨食品有限公司）；
椰牛椰汁（海南新大食品有限公司）；
统一头道榨椰子汁（统一企业中国控股有限公司）；
汇源椰子时光（北京汇源食品饮料有限公司）；
银鹭淳椰汁（厦门银鹭食品集团有限公司）；
欢乐家生榨椰子汁（欢乐家食品集团股份有限公司）；
娃哈哈来一榨（杭州娃哈哈集团有限公司）；
光明一只椰子（光明乳业股份有限公司）；
椰岛椰汁（海南椰岛集团股份有限公司）；
乙腈（色谱纯）；
甲醇（色谱纯）；
三氯乙酸（分析纯）；
氨水（含量25%～28%）；
海沙（化学纯）；
乙酸铵（分析纯）；
三聚氰胺标准品（99.4%，批号G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；
水（GB/T 6682规定一级水）；
三聚氰胺-13C3（100 μg/mL，坛墨质检科技股份有限公司）。
1.3 样品处理
采用GB/T 22388——2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中4.4.1.1小节提取，4.4.2小节净化。
1.4 三聚氰胺标准储备液
准确称取10 mg三聚氰胺标准品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
1.5 三聚氰胺标准及内标中间液
三聚氰胺标准中间液：准确移取25 μL三聚氰胺标准储备液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
三聚氰胺内标中间液：准确移取250 μL三聚氰胺标准储备液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
1.6 液相色谱-质谱/质谱测定
液相色谱及质谱条件参照GB/T 22388——2008。
1.7 基质效益评价方法
运用定量测定空白基质提取液与纯溶剂中同浓度分析物的离子响应程度，通过式（1）计算二者比值以评价基质效应。
式中：A和B分别为基质溶液和纯溶剂分析物的峰面积；
A/B＜80%时，对分析物的响应产生抑制作用；
A/B＞120%，对分析物的响应产生增强作用；
80%＜A/B＜120%，不存在基质效应。
1.8 统计分析
所有数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。
选取我院2017年6月～2018年2月收治的老年冠心病行介入手术患者124例作为研究对象，各62例，干预组中男35例，女27例，年龄（68～76）岁，平均（72.2±1.4）岁。对照组中男30例，女32例，年龄（66～80）岁，平均（73.5±1.5）岁。两组在基本资料的比较上，经统计学处理，无显著性差异。
2.1 取样量对基质效应的影响
分别准确称取0.5和1 g（精确至0.01 g）的10种豆浆样品和10种椰汁样品至具塞塑料离心管，按照1.3小节进行提取和净化处理，按照1.6小节测定并记录峰面积，并按照1.8小节进行统计分析。结果见表1，图1和图2。
图1 取样量对豆浆中三聚氰胺基质效应的影响
图2 取样量对椰汁中三聚氰胺基质效应的影响
表1 取样量对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应分析
由图1得到：豆浆样品取样量为1.00和0.50 g时，三聚氰胺的基质效应分别在17.2%～18.1%和29.7%～30.8%之间，可以看出10种豆浆样品中测得三聚氰胺的基质效应变化比较平缓。由图2得到：椰汁样品取样量为1.00和0.50 g时，三聚氰胺的基质效应分别在11.9%～19.3%和20.5%～29.4%之间，可以看出10种椰汁样品中测得三聚氰胺的基质效应变化起伏较大。结合表1，图1与图2得出，取样量对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应均存在显著性差异。
2.2 溶剂种类对基质效应的影响
分别称取1.00 g（精确至0.01 g）的10种豆浆样品和10种椰汁样品，每种样品称取4份至具塞塑料离心管，并编号为Ⅰ（豆浆、椰汁名称）、Ⅱ（豆浆、椰汁名称）、Ⅲ（豆浆、椰汁名称）、Ⅳ（豆浆、椰汁名称），在Ⅰ号加入10 mL的水，Ⅱ号加入6 mL乙腈和4 mL水，Ⅲ号加入10 mL的三氯乙酸，Ⅳ号加入8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈，按照1.3小节提取净化处理后，供LC-MS/MS测定并记录数据。并按照1.8小节进行统计分析。结果见表2，图3和图4。
图3 溶剂种类对10种豆浆中三聚氰胺基质效应的影响
图4 溶剂种类对10种椰汁中三聚氰胺基质效应的影响
表2 溶剂种类对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应分析
由图3得到：豆浆样品分别加入4种不同溶剂，水、乙腈-水（3∶2，V/V）、三氯乙酸、三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）的三聚氰胺基质效应分别为30.3%～33.7%，24.0%～26.3%，13.7%～14.7%和15.8%～17.8%，可以看出10种豆浆样品中测得三聚氰胺的基质效应变化相对比较平缓，变化差异不大。由图4得到，椰汁样品分别加入4种不同溶剂，水、乙腈-水（3∶2，V/V）、三氯乙酸、三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）的三聚氰胺基质效应分别为28.9%～37.0%，23.6%～30.4%，10.8%～16.5%和11.8%～18.8%，可以看出10种椰汁样品中测得三聚氰胺的基质效应变化起伏相对取样量变化较大，说明溶剂种类对豆浆、椰汁的三聚氰胺的基质效应影响相对较大。结合表2，图3与图4得出，溶剂种类除三氯乙酸与三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应不存在差异，其余均存在显著性差异。
2.3 溶剂用量对基质效应的影响
分别称取1.00 g（精确至0.01 g）的10种豆浆样品和10种椰汁样品，每种样品称取3份放入具塞塑料离心管，并编号为Ⅰ（豆浆、椰汁名称）、Ⅱ（豆浆、椰汁名称）、Ⅲ（豆浆、椰汁名称），在Ⅰ号加入4 mL三氯乙酸和1 mL乙腈，Ⅱ号加入8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈，Ⅲ号加入12 mL三氯乙酸和3 mL乙腈，按照1.3小节提取净化处理后，供LC-MS/MS测定并记录数据。并按照1.8小节进行统计分析。结果见表3，图5和图6。
图5 溶剂用量对豆浆中三聚氰胺基质效应的影响
图6 溶剂用量对椰汁中三聚氰胺基质效应的影响
表3 溶剂用量对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应分析
由图5得到：豆浆样品分别加入5，10和15 mL的提取液（三氯乙酸-乙腈，4∶1，V/V），三聚氰胺的基质效应分别为20.9%～24.3%，17.0%～18.1%和13.0%～14.2%，可以看出10种豆浆样品中测得三聚氰胺的基质效应变化比较平缓。由图6得到：椰汁样品分别加入5，10和15 mL的提取液（三氯乙酸-乙腈，4∶1，V/V），三聚氰胺的基质效应分别为18.1%～25.9%，12.1%～18.9%和8.9%～14.9%，可以看出10种椰汁样品中测得三聚氰胺的基质效应变化起伏相对较大。由表3，图5与图6结合得出，溶剂用量对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应存在显著性差异。
2.4 三聚氰胺浓度对基质效应的影响
分别称取1 g（精确至0.01 g）的10种豆浆样品和10种椰汁样品，每种样品称取3份放入具塞塑料离心管，并编号为Ⅰ（豆浆、椰汁名称）、Ⅱ（豆浆、椰汁名称）、Ⅲ（豆浆、椰汁名称），按照1.3小节的方法提取处理。处理后，取0.1 μL三聚氰胺标准储备液水加入Ⅰ号样液中摇匀，取0.5 μL三聚氰胺标准储备液水加入到Ⅱ号样液中摇匀，取1.0 μL三聚氰胺标准储备液水加入到Ⅲ号样液中，按照1.3小节的方法进行净化处理，供LC-MS/MS测定并记录数据。并按照1.8小节进行统计分析，结果见表4，图7和图8。
图7 三聚氰胺浓度对豆浆三聚氰胺基质效应的影响
图8 三聚氰胺浓度对椰汁三聚氰胺基质效应的影响
表4 三聚氰胺浓度对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应分析
由图7得到：豆浆样品将溶液分别稀释配制成10，50和100 ng/mL，三聚氰胺的基质效应分别为17.1%～19.0%，15.9%～18.7%和17.6%～20.3%，可见10种豆浆样品中测得三聚氰胺的基质效应变化相对比较小。由图8得到，椰汁样品将溶液分别稀释配制成10，50和100 ng/mL，三聚氰胺的基质效应分别为11.0%～19.0%，12.0%～19.3%和12.5%～18.2%，可得10种椰汁样品中测得三聚氰胺的基质效应变化相对较大。结合表4，图7与图8得出，三聚氰胺浓度对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应均不存在显著性差异。
2.5 净化方式对基质效应的影响
分别称取1.00 g（精确至0.01 g）的10种豆浆样品和10种椰汁样品，每种样品称取4份至具塞塑料离心管，并编号为Ⅰ（豆浆、椰汁名称）、Ⅱ（豆浆、椰汁名称）、Ⅲ（豆浆、椰汁名称）、Ⅳ（豆浆、椰汁名称），按照1.3方法进行提取处理后。将Ⅰ号中的净化液进行不过柱，Ⅱ号中的净化液转移固相萃取柱WCX中，Ⅲ号中的净化液转移固相萃取柱Cleanert PCX中，Ⅳ号中的净化液转移固相萃取柱Bond Elut Plexa PCX中，并且按照1.3小节的方法进行净化处理，供 LC-MS/MS测定并记录数据。按照1.8小节进行统计分析，结果见表5，图9和图10。
图9 净化方式对豆浆三聚氰胺基质效应的影响
图10 净化方式对椰汁三聚氰胺基质效应的影响
表5 净化方式对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应分析
表6 三聚氰胺标准曲线
由图9得到，豆浆样品将待净化液分别进行不过柱，过3种类型的固相萃取柱中（WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX）中洗脱，三聚氰胺的基质效应分别为8.8%～10.6%，16.9%～18.0%，15.4%～17.3%和16.1%～18.6%，可见10种豆浆样品中测得三聚氰胺的基质效应变化比较小，变化差异不大。由图10得到，椰汁样品将待净化液分别进行不过柱，过3种类型的固相萃取柱中（WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX）中洗脱，三聚氰胺的基质效应分别为5.4%～11.1%，11.3%～17.7%，10.8%～16.5%和11.8%～18.8%，可见10种椰汁样品中测得三聚氰胺的基质效应变化较大。结合表5，图9与图10得出，净化方式对豆浆、椰汁中三聚氰胺基质效应不存在差异。
2.6 基质效应的消除
绘制标准曲线。分别移取不同体积的三聚氰胺标准中间溶液及相同体积的三聚氰胺内标工作液于6个25 mL容量瓶中，用50%甲醇水逐渐稀释并定容，得到10.00，20.00，40.00，80.00，160.00和200.00 ng/mL的标准工作液，每毫升三聚氰胺标准工作液中含有三聚氰胺内标浓度20 ng/mL，在LC-MS/MS中进样检测，以三聚氰胺的浓度为横坐标和测得并计算三聚氰胺峰面积/内标峰面积的比值为纵坐标作图，得到标准的回归方程曲线。
称量9个空白样品至9个50 mL的具塞塑料离心管中，加入相同体积的20.00 μL内标中间溶液，分别加入25.00，50.00和100.00 μL三聚氰胺标准中间溶液，做三水平三平行回收试验，按照1.3小节进行提取和净化处理，记录各样品三聚氰胺峰面积和内标峰面积，计算加标回收率。
由表7和表8可得，随着加标浓度的变化，回收率均在97.18%～110.5%之间，内标法对三聚氰胺基质效应的消除具有非常显著的效果，彻底消除基质效应，达到理想效果。
表7 豆浆样品加标回收率（n=3）
表8 椰汁样品加标回收率（n=3）
从取样量、溶剂种类和用量、三聚氰胺浓度和净化方式因素研究得出，豆浆中三聚氰胺基质效应的影响不大，但对椰汁样品的影响较大，原因可能是选用的豆浆样品是来自四川乐山当地的豆浆，采用同一种类的豆子、制作工艺和配方，因此基质效应相差不大。但选用的椰汁样品来自不同厂家，采用的椰汁配方、制作工艺和椰子种类都不太相同，因此基质效应相差变化较大。从分析来看：三聚氰胺不同浓度、不同SPE小柱之间和溶剂三氯乙酸与三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）对豆浆、椰汁不存在基质效应，其余均存在显著的基质效应。内标法能彻底除去基质效应的影响。
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