宋月凤，王静茹，国立耘，赵思峰，朱小琼
（1 中国农业大学植物保护学院，农业农村部作物有害生物监测与绿色防控重点实验室，北京 100193）（2 山东省农业广播电视学校聊城市分校）（3 河北雄安新区管理委员会公共服务局）（4 石河子大学农学院）
21 世纪以来，红枣产业在新疆得到大力发展，种植面积与产量均居全国首位[1]。随着红枣产业的快速发展，病虫害大面积发生，其中黑斑病的危害有加重趋势。文献报道[2]和本实验室的研究[3]发现，引起枣黑斑病的病原菌主要为互隔链格孢（Alternaria alternata）。该病在果实上形成褐色至黑色稍凹陷或不凹陷的病斑。在叶片上产生褐色病斑，后期叶片变黄卷曲，提早落叶[4]。
目前生产中主要采用化学杀菌剂防治枣黑斑病。戊唑醇和咪鲜胺均属于甾醇脱甲基抑制剂（DMI），这类杀菌剂能引起细胞膜功能异常，从而影响细胞的生长和增殖[5-6]。异菌脲属于二甲酰亚胺类杀菌剂（DCF），可使病原菌菌丝生长受阻、畸形或胀破，从而起到抑制病原菌的作用[7]。20 世纪90 年代，我国开始对咪鲜胺进行研究，发现其对多种病害均有明显防效，且使用量低[8]，目前在生产中被广泛使用。刘霞等[9]认为，咪鲜胺、戊唑醇和异菌脲对核桃上链格孢的菌丝生长都有较明显的抑制作用。研究表明，相对于多菌灵和甲基硫菌灵，异菌脲、戊唑醇对链格孢菌有更好的抑制效果[10]。
然而，随着用药次数的增加，病原菌繁殖速度快、遗传变异大，容易产生抗药性[11]。戊唑醇自1986年研发成功后，由于其优良特性被广泛应用[6]。现已检测到苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）[12]和草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum）[13]对戊唑醇产生了不同程度的抗药性。崔毓等[11]在新疆阿克苏地区的枣树上也发现了对戊唑醇具有抗药性的链格孢菌株。对于二甲酰亚胺类杀菌剂，病原菌易通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和促分裂活化蛋白激酶的突变产生抗药性[14]。张敏等[15]综合室内和田间的试验结果推测长期单一使用异菌脲会导致链格孢（Alternaria alternata）产生抗药性，且抗性会逐年提升。杨红福等[16]发现，由于长期单一使用咪鲜胺浸种防治水稻恶苗病，导致水稻恶苗病菌对咪鲜胺的抗性大幅度上升，其抗性频率达82.14%。
抗药性的产生给病害防治增加了难度，因此针对新疆枣园黑斑病频发、通常使用杀菌剂进行防治的现状，开展对杀菌剂敏感性测试及抗药性监测对于该病害的防治具有重要意义。本研究通过菌丝生长速率法测定了来自新疆枣上链格孢菌对戊唑醇、异菌脲和咪鲜胺的敏感性，并分析了3 种杀菌剂对分离自不同地区菌株的抑制作用及3 种杀菌剂之间的交互抗药性情况，试验结果将为枣黑斑病的化学防治及抗药性监测提供重要信息和理论依据。
1.1 试验材料
供试菌株为2012—2013 年从新疆红枣主产区阿克苏、阿拉尔等地病果、病叶上分离的45 株链格孢菌和2 株新疆石河子大学赵思峰老师提供的菌株，具体信息见表1。其中7 株来自叶片上，40 株来自果实上。所有菌株均经过单孢分离纯化，通过对菌落形态、产孢表型、分生孢子、分生孢子梗特征的观察及ATPase、ALT、GPD3 个基因的序列和系统发育分析比较综合鉴定为Alternaria alternata[3]。
表1 新疆地区采集的枣上链格孢菌株信息
供试药剂为戊唑醇（96.7%原药，江苏剑牌农药化工有限公司）、异菌脲（98%原药，北京中植科华农业技术有限公司）、咪鲜胺（98%原药，北京中植科华农业技术有限公司）。溶剂为丙酮（99.5%分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、甲醇（99.5%分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、异丙醇（99.7%分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。
含药培养基的制备：用电子天平称取适量的戊唑醇、异菌脲和咪鲜胺的原药，分别溶于异丙醇、丙酮和甲醇中，配成浓度较高的母液。用各自的溶剂分别将母液稀释到所需的质量浓度，取300 μL 稀释液[17]加入到已冷却至60 ℃以下300 mL PDA 培养基中，得到最终需要的含药平板。含药平板中，戊唑醇的浓度为0、0.1、0.25、1、2.5、5 μg/mL，异菌脲的浓度为0、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL，咪鲜胺的浓度为0、0.05、0.25、1、2、4 μg/mL。每个处理重复3 次。
1.2 试验方法
1.2.1采用菌丝生长速率法测试对药剂的敏感性
将供试菌株转接到PDA 培养基中培养4 d 左右，用打孔器在菌落边缘打取直径为5 mm 的菌饼，用接种针挑取菌饼，菌丝面朝下接种于含药平板的中央，26 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗培养。每个处理3 次重复。26 ℃下培养6 d 后，用十字交叉法测量各个平板的菌落直径。计算菌落平均直径，按下列公式计算菌丝生长抑制率。
抑菌率（%）＝［（对照平板菌落直径－含药平板菌落直径）/（对照平板菌落直径－5）］×100
通过Excel 软件进行药剂浓度对数值和菌丝生长抑制几率值之间的线性回归分析，将菌丝生长抑制率转化为几率值，药剂浓度转换为对数值，以X（药剂浓度的对数值）和Y（抑制率对应的几率值）做线性回归分析得到回归方程Y＝a＋bX，当Y＝5时，求出X的反对数[18]即为各药剂的EC50。并制作链格孢菌株对各药剂的敏感性频数分布图。
1.2.23 种杀菌剂对采自枣果实和叶片菌株抑制效果的差异性分析
通过SPSS 软件（IBM SPSS Statistics 23）采用独立样本t 检验法分析3 种杀菌剂对不同部位菌株抑制效果的差异性。以菌株采集部位作为自变量，分为果实和叶片两组，3 种杀菌剂的EC50值为因变量，置信区间为95%。当显著性数值大于0.05 时，则杀菌剂对不同部位菌株的抑制效果无差异；
当显著性数值小于0.05 时，则杀菌剂对不同部位菌株的抑制效果有差异。
1.2.33 种杀菌剂对采自不同地区菌株抑制效果的差异性分析
通过SPSS 软件采用独立样本t 检验法分析3 种杀菌剂对不同地区菌株抑制效果的差异性。以菌株采集地点作为自变量，分为阿拉尔市和阿克苏市两组，3种杀菌剂的EC50值为因变量，置信区间为95%。当显著性数值大于0.05 时，则杀菌剂对不同地区菌株的抑制效果无差异；
当显著性数值小于0.05 时，则杀菌剂对不同地区菌株的抑制效果有差异。
1.2.43 种杀菌剂EC50的相关性分析
将3 种药剂EC50值对应导入SPSS 软件中，作出散点图，然后用皮尔森相关性算法计算两两药剂对链格孢防治效果的相关性（a＝0.05）。-1＜r＜1，r 的绝对值越接近1，表明相关性越强，越接近于0，说明相关性越弱。相关程度划分如下：0.8＜|r|＜1.0，为极强相关；
0.6＜|r|＜0.8，为强相关；
0.4＜|r|＜0.6，为中等程度相关；
0.2＜|r|＜0.4，为弱相关；
0.0＜|r|＜0.2，为极弱相关或无相关。
2.1 链格孢菌株对3 种杀菌剂的敏感性
戊唑醇可以有效抑制链格孢菌株的菌丝生长，菌落直径随着药剂浓度的增加而逐渐减小（图1）。戊唑醇抑制链格孢菌的EC50处于0.362～4.512 μg/mL 之间，中值为0.768 μg/mL，最高值是最低值的12.46 倍，EC50平均值为（1.010±0.691）μg/mL。根据EC50极差R＝maxX－minX＝4.512－0.362＝4.150 μg/mL，将EC50数据分成10 组，戊唑醇对47株链格孢菌株EC50的频数分布呈现单峰曲线（图2）。用SPSS 软件中的K-S 检验得到P为0＜0.05，不符合正态分布。大多数菌株保持敏感，但菌株H6的EC50值为4.512 μg/mL，明显高于其他菌株，出现了敏感性下降的亚群体。
图1 不同浓度戊唑醇对新疆枣上链格孢菌株的抑制效果
图2 戊唑醇对新疆枣上链格孢菌的EC50频数分布
异菌脲能有效地抑制链格孢菌株的菌丝生长，菌落直径随着药剂浓度增加而逐渐减小。异菌脲对链格孢菌株的EC50处于0.407～1.207 μg/mL 之间，最高值是最低值的2.96 倍，EC50平均值为（0.764±0.178）μg/mL。根据EC50极差R＝maxX－minX＝1.207－0.407＝0.800 μg/mL，将EC50数据分成9 组，异菌脲对47 株链格孢菌株的EC50频数分布呈现单峰曲线（图3）。用SPSS 软件中的K-S 检验得到P为0.2＞0.05，符合正态分布。
图3 异菌脲对新疆枣上链格孢菌的EC50频数分布
咪鲜胺能有效地抑制链格孢菌株的菌丝生长，菌落直径随着杀菌剂浓度增大而逐渐减小。咪鲜胺对链格孢菌株的EC50处于0.163～2.198 μg/mL 之间，最高值约是最低值的13.48 倍，EC50平均值为（0.776±0.421）μg/mL。根据EC50极差R＝maxX－minX＝2.198－0.163＝2.035 μg/mL，将EC50数据分成8 组，咪鲜胺对47 株链格孢菌株的EC50频数分布呈现单峰曲线（图4）。用SPSS 软件中的K-S 检验得到P为0.2＞0.05，符合正态分布。
图4 咪鲜胺对新疆枣上链格孢菌的EC50频数分布
2.2 3 种杀菌剂对来自不同采样部位菌株抑制效果的比较
通过独立样本t 检验法分析3 种杀菌剂对采自果实和叶片菌株抑制效果的差异性，由于在戊唑醇对链格孢菌株EC50值中，菌株H6 的EC50明显高于其他菌株，导致EC50值频率不符合正态分布，因此3 项独立样本t 检验及后续的相关性检测中是在去除H6 菌株的EC50值后再进行分析。结果显示，戊唑醇、异菌脲及咪鲜胺对来自果实和叶片菌株抑制效果的独立样本t 检验显著性数值分别为0.164、0.424 和0.742，全部大于0.05（表2），因此来自果实和叶片的菌株对3 种杀菌剂的敏感性没有相关性。
表2 3 种杀菌剂对来自不同采样部位菌株的抑制效果
2.3 3 种杀菌剂对来自不同地区菌株抑制效果的比较
通过独立样本t 检验法分析3 种杀菌剂对不同地区菌株抑制效果的差异性。由于塔里木大学、喀什地区、和田地区的样本量太少，故只对阿拉尔市和阿克苏市采集的菌株进行独立t 检验。结果显示，戊唑醇、异菌脲及咪鲜胺对来自阿拉尔市和阿克苏市菌株抑制效果的独立样本t 检验显著性数值分别为0.270、0.796 和0.377，全部大于0.05（表3），因此来自不同地区的菌株对3 种杀菌剂的敏感性没有相关性。
表3 3 种杀菌剂对来自不同地区菌株抑制效果的差异性
2.4 3 种杀菌剂之间的交互抗药性分析
用46 株链格孢菌株对戊唑醇、异菌脲、咪鲜胺3 种药剂敏感性的EC50进行皮尔森相关性分析。结果显示，戊唑醇与异菌脲的相关系数为0.327，为弱相关；
戊唑醇与咪鲜胺的相关系数为0.084，为极弱相关；
咪鲜胺与异菌脲的相关系数为0.161，为极弱相关（图5）。
图5 3 种药剂EC50的皮尔森相关性分析
有效地防治链格孢引起的黑斑病，监测病原菌对药剂的敏感性并制定科学的施药方案十分重要。本研究采用菌丝生长速率法研究了在新疆不同枣产区采集的47 株链格孢菌对三唑类杀菌剂戊唑醇、二甲酰亚胺类杀菌剂异菌脲和咪唑类杀菌剂咪鲜胺的敏感性，结果表明，3 种杀菌剂均能有效抑制链格孢菌的菌丝生长。
在本试验中，戊唑醇抑制链格孢菌株的EC50平均值为1.010 μg/mL，戊唑醇的EC50频数分布呈现单峰曲线。崔毓等[11]通过菌丝生长速率法，采用来源于未使用过戊唑醇的果园的菌株，建立了枣黑斑病病原菌对戊唑醇的敏感基线（0.168 μg/mL），该研究用到的药剂为制剂而不是原药，因而与本研究结果之间无法进行比较。刘霞等[9]、刘础荣等[5]的试验中，戊唑醇对核桃和枣上链格孢菌抑制的EC50平均值分别为1.78、3.25 μg/mL，两项研究中的平均EC50值均高于本研究得到的值。异菌脲和咪鲜胺抑制47株链格孢菌株的平均EC50值分别为0.764、0.776 μg/mL，两种药剂EC50频数分布均符合正态分布。因此可将供试菌株的平均EC50值作为枣黑斑病菌对戊唑醇、异菌脲、咪鲜胺的敏感基线，作为将来开展枣黑斑病菌田间抗药性监测的参考。
戊唑醇、异菌脲、咪鲜胺都能有效地抑制链格孢菌丝生长，但长期、连续多次地使用单一杀菌剂会产生抗药性[19]。为延缓抗药性的产生，延长杀菌剂的使用时间，田间生产时应选用不同种类的杀菌剂轮换使用[20]。鄢海峰等[21]发现防治由链格孢属真菌引起的苹果斑点落叶病，异菌脲与戊唑醇质量比4∶1 的复配剂比单剂防治效果更好，并且用药量更低。无论是田间自然产生还是实验室诱导产生对异菌脲有抗性的链格孢菌都对戊唑醇敏感，表明异菌脲与戊唑醇之间没有交互抗药性[22]。本试验对3 种杀菌剂抑制病原菌的效果进行皮尔森相关性分析，3种杀菌剂对病原菌的抑制效果之间为弱相关和极弱相关。上述结果表明，戊唑醇、异菌脲、咪鲜胺3种杀菌剂之间没有交互抗性，生产上可以将3 种杀菌剂交替使用，延缓抗药性的产生。
综上所述，新疆枣不同生长时期可以采用戊唑醇、咪鲜胺等药剂防治链格孢引起的枣黑斑病。在化学药剂防治方面，需要持续关注链格孢菌的抗药性，开展抗药性监测，为田间枣黑斑病的防治及抗药性治理提供参考信息。
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