侯燕红，段新慧，栾旭辉，周 凯，韩 博，姜 华，何承刚
(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201)
野豌豆属(ViciaL.)是豆科(Leguminosae)野豌豆族(Viciae)的一年、两年或多年生草本植物，由林奈建于1753 年，中国现有本属植物43 种5 变种[1]。该属植物具有清香味，可作野生蔬菜食用；
其吸收磷肥能力强，又被广泛用作绿肥作物；
有的还可以入药[2]；
最重要的是其生育周期短、蛋白质含量高和适口性好，被世界各国作为优良牧草广泛栽培。但由于其植株形态差异较大且没有具体的鉴定依据，给该属植物的识别带来了较大的困难。国内外诸多学者先后从细胞学[3]、花粉学[4]、解剖学[5]、分类学[6]和分子生物学[7]等方面对其进行了研究，为深入了解本属植物资源奠定了良好的基础。
叶片作为植物直接接受光照的器官，其形态特征相对保守和稳定，对植物系统的分类研究具有重要意义[8]。史传奇等[9]深入研究了东北豆科山羊豆族4 属25 种植物叶的形态结构，发现托叶质地、托叶与叶柄联合程度及小叶叶缘是否反卷等特征可作为棘豆属的识别特征。DOGAN 等[10]将叶片形态与花和果实形态特征相结合，运用数量分类学方法证明叶长、小叶数、托叶形状及叶轴末端是否具卷须等叶片形态特征对土耳其山黧豆属组间划分具有重要作用。郑太坤等[11]对4 种野豌豆属植物的研究表明：通过小叶形状可区分部分野豌豆属植物。常媛飞等[12]通过对野豌豆属14 个牧草幼苗形态多样性指标的研究，提出五叶期株高和茎柔毛密度等指标可作为本属植物分类鉴定的依据。植物叶表皮微形态特征也同样具有重要的分类价值，可为植物在种及亚种水平上的分类提供依据[13-14]。许少祺等[15]对山野豌豆和大叶野豌豆的叶片微形态进行研究，发现其叶表皮微形态结构之间有所不同。雒宏佳[16]研究了野豌豆属植物叶表皮微形态特征，提出叶表皮微形态特征可为区分种提供依据。还有学者对29 种野豌豆属植物叶表皮微形态特征进行了观察，发现这些特征在属内组间没有明确的规律性，但可为探讨该属种间的分类学及亲缘关系提供依据[17]。植物叶片的宏观形态和微观形态在分类学上均具有重要意义，但是前人对野豌豆属植物分类的研究较为单一，目前，将叶片宏观形态和微观形态结合对其分类的研究还比较缺乏，因此，本研究以云南9 份野豌豆属牧草资源为材料，对其叶片的宏观形态和微观形态进行研究，通过相关性、遗传多样性、主成分和聚类方法，分析各材料叶片性状间的主要差异，得出野豌豆属植物的叶片形态特征鉴别依据，为进一步研究本属植物分类及系统学提供形态学基础资料。
1.1 试验材料
供试材料为9 份野豌豆属植物资源的种子(表1)。将挑选出来的优质种子种植于云南农业大学草学系植物生长室，自种植之日开始观察、记录其形态特征，并进行正常养护管理。
表1 供试材料与来源Tab.1 Test materials and their sources
1.2 观测项目
1.2.1 宏观性状
从植物出苗时开始观察并测量植物叶片的宏观性状，指标测量和记录参考常媛飞等[12]的方法，每次测量重复5 次。五叶期后观察记录小叶形状、茎柔毛密度、小叶尖端锯齿情况和卷须柔毛密度等性状指标。上述质量性状采用赋值的方法进行记录，测量指标和赋值方法参考常媛飞等[12]的方法(表2)。
表2 野豌豆属叶片宏观和微观性状测定指标Tab.2 Measurement indexes of leaf macroscopic and microscopic traits inVicia
1.2.2 微观性状
分别取各野豌豆属植物中部成熟健康的叶片1～2 片，撕取叶片下表皮制成临时装片。用光学显微镜在40 倍物镜下对20 个视野中的细胞形状和气孔器类型等指标进行观察、测量并拍照，各指标测定标准见表2。
1.3 数据统计与分析
采用Excel 2019 对各性状进行统计，9 种材料的宏观性状变异系数及遗传多样性指数的计算参照王继师等[18]的方法；
采用SPSS 26 对所有性状进行主成分分析、相关性分析和聚类分析。
2.1 叶片宏观性状分析
9 份材料宏观性状的差异和遗传多样性分析结果见表3。9 份材料的小叶尖端均有锯齿，小叶相对大小差异明显，小叶背面颜色大多较正面颜色淡。14 个指标的变异范围在0.00%～49.13%之间，其中小叶尖端锯齿的变异系数为0.00%，即种间无差异，茎柔毛密度的变异系数高达49.13%；
遗传多样性指数范围在0.00～1.06 之间，其中最小的是小叶尖端锯齿，最大的是茎柔毛密度，其余性状的遗传多样性指数均小于1.00。
表3 宏观性状的变异分析及遗传多样性分析Tab.3 Variation analysis and genetic diversity analysis of macroscopic traits
2.2 叶片微观形态分析
由表4 可知：兰花苕子2 的气孔长度显著大于除四籽野豌豆和光叶紫花苕2 外的其他材料(P＜0.05)，毛叶苕子的气孔长度最小(20.51 μm)；
四籽野豌豆、兰花苕子1、兰花苕子2、光叶紫花苕2 和箭筈豌豆1 的气孔宽度差异不显著(P＞0.05)，且均显著大于光叶紫花苕1 和毛叶苕子(P＜0.05)；
光叶紫花苕1 的气孔器显著大于兰花苕子1、光叶紫花苕2 和箭筈豌豆1 (P＜0.05)，且后三者之间差异不显著(P＞0.05)，其余6 个材料间差异也不显著(P＞0.05)；
箭筈豌豆1 的气孔指数显著大于其他材料(P＜0.05)，四籽野豌豆的气孔指数最小(4.68%)；
箭筈豌豆1 的气孔密度显著大于其他材料(P＜0.05)，多叶野豌豆和箭筈豌豆2 之间差异不显著(P＞0.05)，且显著高于除箭筈豌豆1 外的其他材料(P＜0.05)；
9 个材料的细胞形状、垂周壁式样和气孔器类型均一致。
表4 野豌豆属植物叶片下表皮植纹特征Tab.4 Characteristics of leaf lower epidermal plant print ofViciaspecies
2.3 叶片形态主成分分析
由于小叶尖端锯齿情况、细胞形状、垂周壁式样和气孔器类型无差异，故以上指标不进行主成分分析和相关性分析。
由表5 可知：前5 个主成分特征值大于1，累计贡献率达到92.02%，包含了13 个叶片宏观形态和5 个叶表皮微形态的绝大部分信息。5 个主成分中载荷较高的性状为茎柔毛密度、小叶柔毛密度、托叶大小、气孔指数和气孔密度。
表5 野豌豆属叶片形态的主成分载荷矩阵和累计贡献率Tab.5 Principal component loading matrix and cumulative contribution rate of leaf morphological inVicia
2.4 叶片形态相关性分析
由表6 可知：小叶形状与茎柔毛密度、小叶柔毛密度、气孔指数和气孔密度均呈极显著负相关(P＜0.01)；
茎柔毛密度与小叶尖端形状和小叶柔毛密度呈极显著正相关(P＜0.01)，且与托叶大小、气孔指数和气孔密度呈显著正相关(P＜0.05)；
托叶大小与托叶有无锯齿呈极显著正相关(P＜0.01)；
气孔指数与气孔密度呈极显著正相关(P＜0.01)。
表6 野豌豆属植物宏观和微观形态性状的相关性Tab.6 Correlation of leaf macroscopic and microscopic traits inVicia
2.5 叶片形态聚类分析
由图1 可知：相对距离为15 时，9 份野豌豆属植物可以聚为2 类：四籽野豌豆单独成为一类，其余8 份野豌豆属植物聚成第2 类；
相对距离为11 时，9 份野豌豆属植物可以聚为4 类：第1 类群由兰花苕子2、兰花苕子1、光叶紫花苕1 和光叶紫花苕2 组成，第2 类群由毛叶苕子组成，第3 类群由箭筈豌豆1、箭筈豌豆2 和多叶野豌豆组成，第4 类群由四籽野豌豆组成。
图1 9 份野豌豆属材料叶片形态的聚类结果Fig.1 Morphological clustering results of leaf in nineVicia
本研究对9 份供试材料的叶片、柔毛和卷须等宏观性状及下表皮微观性状的差异进行对比分析，结果表明：不同种间野豌豆属牧草叶片形态差异较大，有利于分类。植物叶片形态往往可区分物种，本研究中四籽野豌豆叶片为椭圆形，毛叶苕子叶片为长椭圆形，箭筈豌豆叶片为长椭圆形，该结果与王燕红等[19]的调查结果一致，表明野豌豆属植物叶片形态表现较为稳定。除四籽野豌豆与毛叶苕子的托叶无锯齿外，其余7 种野豌豆属植物托叶均有锯齿，与《中国植物志》中的记载一致。四籽野豌豆小叶不被毛，兰花苕子和光叶紫花苕小叶被毛稀疏，毛叶苕子小叶被毛密集，这与植物本身的植株特征相吻合。供试9 份材料托叶形状多样，种间变异大，光叶紫花苕托叶形状为半箭头形，与刘云波等[20]的研究结果一致。《中国植物志》中记载野豌豆属植物成株多有卷须并且分支，但本研究中仅有四籽野豌豆出现分支，推测是由于本研究观测时间较早，其余植株尚未形成卷须分支，表明野豌豆属植物的卷须是随着时间的推移而日渐成熟并发达。野豌豆属植物的叶片形态差异一般较大，对其进行研究有利于野豌豆属植物的快速鉴别。叶片表皮微形态的研究显示：9 份野豌豆属植物材料的表皮细胞均为不规则形，垂周壁式样均为深波状，气孔器类型均为无规则形，这与史传奇等[21]和雒宏佳[16]的研究结果一致。9 份野豌豆属材料的气孔大小种间差异不大，气孔指数与气孔密度种间有明显差异，有研究表明：气孔指数与气孔密度反映植物对干旱环境的适应性，二者值越大则植物的抗旱能力越强[22]，本研究中多叶野豌豆和箭筈豌豆的气孔密度与气孔指数均较大，推测这2 种植物抗旱性较强。
对野豌豆属9 份材料的18 个指标进行主成分分析发现：茎柔毛密度、小叶柔毛密度、托叶大小、气孔指数和气孔密度在其对应成分中载荷较高，包含本研究所有形态性状的绝大部分信息，反映出各材料间的遗传差异，故可以将这5 个指标作为区分野豌豆属不同种的依据。野豌豆属植物各形态性状间也会互相影响和随之变化。叶片形态相关性分析中，小叶柔毛密度与托叶大小和有无锯齿呈显著正相关，与尚宏芹[23]对辣椒形态结构的研究结果不同，这可能是由于植物不同所致；
茎柔毛密度与小叶柔毛密度呈极显著正相关，这与常媛飞等[12]的研究结果一致。
野豌豆属植物叶片宏观和微观形态的聚类分析结果显示：第1 分支由光叶紫花苕和兰花苕子(也称广布野豌豆)组成，与毛叶苕子(也称长柔毛野豌豆)聚为一类，说明这3 种植物间的遗传关系较近。夏振岱[24]将长柔毛野豌豆和广布野豌豆划分在细叶野豌豆组中；
刘博文等[25]对43 份野豌豆属种子的形态聚类分析也将长柔毛野豌豆与广布野豌豆聚为一类；
贺蓉等[26]应用聚类分析方法对华北地区野豌豆属进行研究，发现长柔毛野豌豆与广布野豌豆亲缘关系较近，这些研究结果均与本研究结果相似。在夏振岱[24]的分类系统中，四籽野豌豆和多叶野豌豆属于四籽野豌豆组，但本研究中四籽野豌豆单独聚为一支，有可能是植株受到了环境的影响产生了变异，导致该现象的原因还有待进一步深入研究。
9 份野豌豆属牧草的叶片形态表现出丰富的差异性，其中茎柔毛密度、小叶柔毛密度、托叶大小、气孔指数和气孔密度5 个指标可以为野豌豆属植物的分类鉴定提供依据。
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