王夏茵，岳宝森，张炜华，田欢，杨帅，王巧玲，李爱婷，职媛，赵锋（西安市中医医院，西安 710000）
天麻，又名赤箭，始载于《神农本草经》[1-2]，为兰科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎[3]，是药食两用、名贵中药材[4]。随着人工栽培技术的发展，天麻在我国多个省份均有分布，但不同产地之间气候条件、品种基原及加工方式的不同导致其存在质量差异。为了保证天麻药材成分及疗效的稳定性，对不同产地天麻的质量进行控制显得尤为重要。
目前，指纹图谱被广泛用于天麻的质量控制[5-7]，化学模式识别技术可对指纹图谱信息进行数字化识别与处理，进一步评价中药质量[8-9]。研究者前期通过2020年版《中国药典》中指纹图谱方法，对来自7个主要产地的21批天麻样品进行分析，发现该方法下湖南、湖北天麻色谱峰分离度较差。湖南地区是我国天麻主要产区之一[10-11]，研究者查阅资料发现湖南天麻少见报道。本研究通过HPLC建立不同产地天麻指纹图谱，测定天麻素和对羟基苯甲醇的含量，并结合化学模式识别技术对包括湖南、湖北天麻在内的7个主要产地21批天麻样品进行分析，为天麻质量控制及综合评价提供参考。
1.1 仪器
TDZ5-BP台式高速离心机（陕西德祥实验设备有限公司）；
ZA305AS电子天平（十万分之一天平，上海赞维衡器有限公司）；
LC-20A高效液相色谱仪（配置Lab Solutions色谱工作站，日本岛津公司）；
CQ-150A-DST超声波清洗机（上海跃进仪器厂）。
1.2 试药
对照品天麻素（批号：110807-202010，含量：95.5%）、对羟基苯甲醇（批号：111970-201702，含量：99.4%）（中国食品药品检定研究院）；
对照品巴利森苷A（批号：03F-RTY-12-0，含量：98.65%）、巴利森苷B（批号：19J-PGH-22-1，含量：99.49%）、巴利森苷C（批号：19J-GTR-19-2，含量：97%）、巴利森苷E（批号：19J-FTR-20-1，含量：97%）（Panphy Chemicals Corporation）；
乙腈为色谱纯（Grace Chemical Technology Co.，Ltd.）；
21批天麻药材经西安市中医医院药剂科岳宝森主任鉴定，为兰科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎，药材来源具体信息见表1。
表1 天麻药材来源信息Tab 1 Source information of Gastrodia elata Bl.
2.1 色谱条件
色谱柱：Inertsustain C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；
流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～15 min，2%～5%A；
15～25 min，5%～12%A；
25～45 min，12%～18%A；
45～60 min，18%～25%A；
60～62 min，25%～95%A）；
流速1 mL·min－1；
进样量3 μL；
柱温30℃；
检测波长220 nm。
2.2 不同产地天麻指纹图谱的建立
2.2.1 供试品溶液制备 精密称定天麻药材粉末（过3号筛）约1 g，置于具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25 mL，称定重量，超声30 min，放凉后，50%甲醇补足减失重量，离心，上清液过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，加50%甲醇配制成含巴利森苷C 0.88 mg·mL－1、天麻素 1.98 mg·mL－1、巴利森苷A 1.80 mg·mL－1、对羟基苯甲醇 1.70 mg·mL－1、巴利森苷E 1.76 mg·mL－1、巴利森苷B 2.04 mg·mL－1的混合对照品溶液。
2.2.3 精密度试验 取S9号供试品溶液，连续进样6次，以天麻素为参照峰，其余5个共有特征峰（8、11、13、14、16号峰）相对保留时间RSD值为0.11%～0.26%，相对峰面积RSD值为0.74%～2.8%，表明仪器精密度良好。
2.2.4 稳定性试验 取S9号供试品溶液，分别于0、1、2、6、12、24 h进样，以天麻素为参照峰，其余5个共有特征峰相对保留时间RSD值为0.13%～0.33%，相对峰面积RSD值为0.29%～3.2%，表明24 h内样品稳定性良好。
2.2.5 重复性试验 平行制备S9号供试品溶液6份，进样分析，以天麻素为参照峰，其余5个共有特征峰相对保留时间RSD值为0.19%～0.30%，相对峰面积RSD值为0.76%～3.5%，表明方法重复性良好。
2.2.6 指纹图谱建立及分析 取21批天麻样品，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样测定并记录色谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行分析，以S9为参照，设时间窗宽度0.5 min，采用中位数法计算，生成对照指纹图谱，选定16个共有峰进行多点校正，自动匹配后得到21批天麻样品指纹图谱叠加图，见图1[12-14]。相似度评价作为中药指纹图谱的重要评价手段，可反映多个样本间化学成分差异及离散程度[15-16]，通过相似度分析，得出21批样品与对照指纹图谱相似度为0.758～0.995，见表2，说明不同批次天麻存在一定差异[14]。
图1 不同产地天麻指纹图谱叠加图Fig 1 Fingerprint chromatograms of Gastrodia elata Bl. from different regions
表2 不同产地天麻相似度评价结果Tab 2 Similarity of Gastrodia elata Bl. from different regions
通过对照品比对，指认其中6个特征峰，分别为7号峰（天麻素）、8号峰（对羟基苯甲醇）、11号峰（巴利森苷E）、13号峰（巴利森苷B）、14号峰（巴利森苷C）、16号峰（巴利森苷A），见图2。
图2 混合对照品（A）与天麻样品（B）的色谱图Fig 2 Chromatogram of mixed reference substances（A）and Gastrodia elata Bl.（B）
2.3 不同产地天麻中天麻素及对羟基苯甲醇的含量测定
2.3.1 供试品溶液制备 同“2.2.1”项下方法操作。
2.3.2 对照品溶液制备 分别精密称定天麻素12 mg、对羟基苯甲醇6 mg置于10 mL量瓶中，加入50%甲醇充分溶解定容，得各对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量，加50%甲醇配制成含天麻素24、72、120、240、360、720 μg·mL－1，对羟基苯甲醇6、24、48、60、120、240 μg·mL－1的混合对照品溶液。
2.3.3 线性关系考察 取“2.3.2”项下混合对照品溶液，进样测定，以质量浓度（μg·mL－1）为横坐标，峰面积为纵坐标建立回归方程，结果天麻素的回归方程为Y＝5.639×103X－2.151×104（r＝0.9990），对羟基苯甲醇的回归方程为Y＝1.300×104X－3.492×104（r＝0.9989）。
2.3.4 精密度试验 取S9号供试品溶液，连续进样6次，天麻素和对羟基苯甲醇峰面积RSD值分别为0.63%和3.1%，表明仪器精密度良好。
2.3.5 稳定性试验 取S9号供试品溶液，分别于0、1、2、6、12、24 h进样，天麻素和对羟基苯甲醇峰面积RSD值分别为1.0%和3.5%，表明24 h内样品稳定性良好。
2.3.6 重复性试验 平行制备S9号供试品溶液6份，进样分析，天麻素和对羟基苯甲醇峰面积RSD值分别为2.0%和4.3%，表明方法重复性良好。
2.3.7 加样回收试验 精密称定S9号样品约1 g，分别按已知含量的80%、100%、120%加入天麻素4.5、5.5、7.0 mg，对羟基苯甲醇储备液0.8、1.0、1.2 mL，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液各3份，进样测定，结果天麻素和对羟基苯甲醇加样回收率分别在103.81%～104.59%和100.84%～104.42%，RSD值分别在0.96%～3.9%和1.0%～4.0%，表明此方法准确可行。
2.3.8 含量测定 取S1～S21号样品，按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液各2份，进样测定，结果见表3。
表3 不同产地天麻的含量测定(n＝2，%)Tab 3 Content of Gastrodia elata Bl. from different regions (n＝2，%)
2.4 化学模式识别分析
2.4.1 聚类分析（CA） 将21批天麻指纹图谱中共有峰峰面积导入SPSS 25.0分析软件进行CA分析[17]。当分类距离为15时，可将21批天麻样品归为两类，其中湖南、湖北天麻（S16～S21）归为一类，其他产地天麻（S1～S15）归为一类，结果见图3。
图3 不同产地天麻CA结果Fig 3 Cluster analysis of Gastrodia elata Bl. from different regions
2.4.2 主成分分析（PCA） 将21批天麻指纹图谱中共有峰峰面积导入软件SIMCA14.1中，建立PCA模型，累计贡献率R2X＝0.593，表明模型可较好解释原始变量，得分见图4[17]。结果显示21批天麻样品基本分为两类，与CA结果一致。
图4 不同产地天麻PCA得分图Fig 4 PCA score plot of Gastrodia elata Bl. from different regions
2.4.3 偏最小二乘法分析（OPLS-DA） 将21批天麻指纹图谱中共有峰峰面积导入软件SIMCA14.1中，建立OPLS-DA模型[18]，模型解释率参数R2X＝0.534，R2Y＝0.924，模型预测能力参数Q2＝0.826，表明模型解释与预测能力良好，OPLS-DA模型结果与CA、PCA结果一致，进一步验证了分析结果的可靠性，见图5。提取16个共有峰变量重要性投影（VIP）值并进行排序，见图6，结果显示峰6、16（PA）、13（PB）、14（PC）、11（PE）、1、7（天麻素）、12的VIP值均＞1，表示这8个成分可作为评价湖南、湖北天麻与其他产地天麻的差异性标记成分[19]。
图5 不同产地天麻OPLS-DA得分图Fig 5 OPLS-DA score plot of Gastrodia elata Bl. from different regions
图6 不同产地天麻差异标志物VIP图Fig 6 VIP diagram of Gastrodia elata Bl. from different regions
3.1 方法学的优化
对提取溶剂（50%甲醇、50%乙醇、60%甲醇、60%乙醇）、提取时间（15、30、45 min）、检测波长（220、254、270 nm）及流动相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸）进行考察，以分离度、共有峰面积、峰形及提取效率为考察指标，最终确定本文提取条件（以50%甲醇为溶剂，超声提取30 min）及色谱条件（波长220 nm下，以乙腈-0.1%磷酸为流动相）。
3.2 指纹图谱的建立与分析
前期试验过程中发现，湖南、湖北地区天麻6号峰面积较大，使用药典方法无法有效分离6号峰和7号峰（天麻素）。本研究建立了天麻HPLC指纹图谱，对包括湖南、湖北在内的7个主要产地21批天麻样品分离度良好，标定16个共有指纹峰，并指认了其中6个成分。通过相似度分析，21批天麻样品与对照指纹图谱相似度为0.758～0.995，其中云南、贵州、陕西、安徽、四川产天麻与对照指纹图谱相似度较高（0.947～0.995），湖南、湖北产天麻与对照指纹图谱相似度较低（0.758～0.917）。
3.3 含量测定的分析
2020年版《中国药典》以天麻素和对羟基苯甲醇的总量对天麻进行含量测定，本研究中21批样品中天麻素和对羟基苯甲醇总量为0.21%～0.80%，其中云南、贵州地区天麻不同批次间稳定性好、总含量高，分别为0.58%、0.62%，湖南、湖北地区总含量较其他产地偏低，分别为0.24%、0.33%。
3.4 化学模式识别分析
通过CA、PCA可将21批天麻分为湖南、湖北天麻与其他产地天麻两类。通过OPLS-DA筛选出8个差异标记物，包含天麻素（6号峰）、巴利森苷类成分（16号峰巴利森苷A、13号峰巴利森苷B、14号峰巴利森苷C、11号峰巴利森苷E）及3个未知成分（6、1、12号峰）。天麻素和巴利森苷类成分是天麻的主要活性成分，受地域环境、种植技术等多因素影响，2020年版《中国药典》新增天麻素和巴利森苷类成分建立指纹图谱对天麻进行质量控制。本研究发现，天麻素和巴利森苷类成分可用于区分湖南、湖北天麻与其他产地天麻的差异，是天麻重要质控成分。查阅文献，关于湖南、湖北天麻与其他产地天麻的综合评价少见报道，包永睿等[20]通过CA将10个不同产地天麻分为三类，区别于贵州、安徽等地，湖北、四川天麻归为一类；
林昕等[5]将12个不同产地天麻分为三类，区别于陕西、贵州等地，湖北、西藏和辽宁归为一类，与本研究结果一致。考虑到本研究纳入单个产地样本量较少，仅3个批次，故通过本研究可认为湖南、湖北天麻与其他产地天麻可能存在一定差异，但后期仍需要大样本研究进一步证实。
