曾女金，邢孟韬，何玲（中国药科大学药学院，南京 211198）
胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是一种常见的脑肿瘤，恶性程度高，被世界卫生组织归类为Ⅳ级胶质瘤，年发病率约4.03/10万[1]。目前针对胶质瘤的治疗以最大程度手术切除为主，辅以放化疗。但综合治疗后，大多数患者仍在相对较短的时间内复发，且复发肿瘤往往更具侵袭性和耐药性，导致患者预后不良，中位生存期少于两年[2]。减少GBM复发是亟待解决的临床问题。
DNA损伤性化疗药物和辐照可能引起肿瘤细胞和非肿瘤细胞的衰老，这种现象被称为治疗诱导性衰老（therapy-induced senescence，TIS）[3]。GBM具有高侵袭性，虽然目前对GBM的最大安全性切除通常包括肿瘤以外的区域，但切除边缘仍可能存在残留GBM细胞[4]。浸润到正常组织中的肿瘤细胞在放化疗作用下被诱导衰老，生长增殖受到抑制，使患者受益。但越来越多的临床及临床前研究证据表明，放化疗会引起肿瘤和正常组织中衰老细胞累积，持续增加的衰老细胞可能分泌多种促肿瘤因子，诱导GBM复发[5-6]；
且残留GBM细胞在治疗压力诱导的衰老状态下可能转化为对治疗有更高抗性的分子亚型，产生恶性更强的复发肿瘤[7-8]，引起患者不良预后，表现出比初发时更高的转移率和病死率。基于衰老细胞在肿瘤治疗中的双重作用，完善TIS有关治疗策略成为众多科学家关注的焦点。本文就TIS对GBM治疗的影响作一综述，旨在为降低GBM复发和研发GBM治疗药物提供参考。
细胞衰老（cellular senescence）是发生在二倍体细胞中的一种稳定的细胞周期停滞现象，最早于19世纪60年代由Hayflick和Moorhead提出[9]。体外培养的人成纤维细胞在连续培养50～70代后即丧失增殖能力并进入生长停滞状态，达到“Hayflick极限”，这种衰老类型被命名为复制型衰老（replicative senescence）。除复制型衰老外，在各种压力刺激下，细胞也会发生衰老，这种衰老没有明显端粒缺失，被命名为早衰，TIS就是早衰的一种[3]。
放化疗引起GBM细胞广泛发生衰老。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是治疗GBM的一线化疗药物，通过诱导O6-甲基鸟嘌呤（O6-methylguanine，O6MeG）发挥细胞毒性作用，诱导DNA双链断裂和细胞死亡。关于替莫唑胺的作用机制研究发现，除诱导凋亡和自噬外，替莫唑胺还可引起胶质瘤细胞大量发生衰老[10]。近期的一项研究指出，使用替莫唑胺处理GBM细胞后，衰老细胞逐渐增多，第8日时达到80%，是凋亡细胞数量的4倍，这表明衰老可能是TMZ治疗后的主要反应[4]。同样，辐照放疗也会诱导细胞衰老[11-12]，实验发现辐照导致60%～80%的GBM细胞生长停滞，进入衰老状态，白细胞介素（IL）-6、IL-1α、IL-1β等衰老相关因子表达增加，NF-κB途径被激活。
通常而言，TIS以一种细胞自主调控的方式限制DNA损伤细胞的增殖，从而阻止肿瘤发展。因此，以各种治疗手段加速肿瘤细胞的衰老成为既往肿瘤治疗的一大理论基石。各种临床常见的化疗药物，如烷化剂、铂类等药物，都是常见的细胞衰老诱导剂；
部分分子靶向药物也可导致细胞衰老，达到治疗肿瘤的目的[13]。然而，随着肿瘤研究的深入，TIS带来的潜在问题逐渐暴露。肿瘤细胞经化疗或放射治疗后进入衰老状态，衰老肿瘤细胞通过退出细胞周期来躲避化疗药物的直接细胞毒性作用，可能在治疗结束后幸存，进入蛰伏状态，伺机而动，引起肿瘤复发。
衰老在过去一直被认为是一种不可逆转的生长停滞状态，但最近的研究表明，一些已表现出衰老的肿瘤细胞亚群可能逃逸衰老，恢复增殖能力，且恢复的细胞可能比亲本细胞群更具侵袭性[14]。基于大规模的表观遗传重编程和增强的可塑性，衰老的肿瘤细胞可能在治疗压力下进化，获得更恶性的表型特征，出现治疗抗性，进而引起肿瘤复发。替莫唑胺诱导的DNA损伤是引起GBM细胞发生衰老的主要触发因素，该过程由MRN-ATR-CHK1途径的激活引发，并依赖于CDC25c降解[15]，此外该过程还伴随着E2F1/DP1复合物的破坏，导致DNA修复因子EXO1、MSH2、MSH6和RAD51的下调，进而引起DNA错配修复和同源重组下调。DNA损伤修复能力下降，积累遗传改变，可能阻碍衰老的诱导和维持，包括CDKN2A纯合子丢失，或TP53相关途径突变[14]。
还有研究揭示，TIS可能通过促进细胞重编程诱导干性表型来推动肿瘤生长[16-17]。衰老的关键组件，如p16INK4a、p21CIP1、p53以及组蛋白H39号位赖氨酸处的三甲基化（H3K9me3）等，也是调节细胞干性的关键因子，表明细胞衰老和细胞干性由重叠的信号网络共同调节[16]。衰老相关的干细胞是一种意料之外的细胞自主特征，在逃离细胞周期阻滞后表现出高侵袭性的生长潜力，并在复发肿瘤中富集。根据基因特征，胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cells，GSCs）可分为前神经型（proneural GSCs，pGSCs）和间质型（mesenchymal GSCs，mGSCs）[18]。在肿瘤治疗中，原发性GBM会倾向于发生原神经-间质转化（proneural-mesenchymal transition，PMT）[19]，pGSCs在放化疗期间，原神经样相关特征（如CD133、OLIG2）减少，间充质样基因特征（如CD44、YKL40）上调，转化为mGSCs，且复发GBM中mGSCs显著增加。PMT过程是GBM复发的关键因素[20]，包含多个信号通路的激活，涉及NF-κB、Notch1、C/EBP-β等关键调节因子。有趣的是，这些信号通路也在TIS中被激活[21]，提示GSCs的PMT过程与衰老相关基因表达特征具有相似性。衰老细胞重编程可能促进GSCs发生干细胞亚型转化，侵袭性增强，恶性程度变高，导致复发和患者不良预后。
除了对肿瘤细胞的影响外，放化疗手段也可能引起脑中非肿瘤细胞发生衰老[6]。星形胶质细胞是大脑中最丰富的细胞类型，研究发现，放疗会引起小鼠大脑中广泛的细胞衰老[22-24]，尤其是星形胶质细胞的衰老，且辐照后衰老的星形胶质细胞促进了小鼠胶质瘤的生长，侵袭性增强。衰老基质细胞通过分泌多种促肿瘤因子，促进邻近肿瘤细胞的生长，包括生长因子、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分等。比如衰老星形胶质细胞过量分泌肝细胞生长因子（HGF），激活间质表皮转化因子（cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET），促进肿瘤细胞在体外的迁移和侵袭；
衰老星形胶质细胞也会产生过量的纤连蛋白，促进细胞存活和侵袭[22]。衰老星形胶质细胞分泌的IL-6和IL-8，可以激活胶质瘤细胞中的NF-κB和STAT3信号传导，以维持其干性并促进其侵袭性。此外，研究发现星形胶质细胞体外诱导衰老后，其培养基中c-Myc水平升高，当与GBM细胞共培养时，增加的c-Myc可以促进GBM细胞增殖，并提高后者对替莫唑胺的耐药性[25]。总之，衰老基质细胞可能通过旁分泌作用促进肿瘤复发，且导致复发肿瘤的治疗抗性。
胶质母细胞瘤常发生于年龄较大的人，其中确诊为异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）野生型肿瘤的患者中位年龄是62岁[5，26]。确诊时的年龄与生存率成负相关，这种不良预后主要归因于肿瘤切除程度以及与高龄相关的体质虚弱或恢复不佳，但有学者指出这可能在一定程度上也与大脑老化有关[5]。脑中增多的衰老细胞既是人衰老的原因，也促进了癌症的发展，且年龄相关性炎症已在多种肿瘤的发生发展中被证明[27]。矛盾的是，放射治疗和各种抗癌化疗药物引起肿瘤细胞和非肿瘤细胞的衰老，造成组织内衰老细胞大量增加；
且TIS会降低免疫系统对衰老肿瘤细胞的去除效率，进一步导致衰老细胞在肿瘤和治疗小鼠的正常组织中积累[3]。这意味着当对GBM患者采用放化疗手段治疗时，本身就可能会诱导其脑部衰老细胞的增加，这可能导致进一步的不良预后，包括复发。
衰老细胞具有增强的分泌活性，产生衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），包括炎症介质、生长因子、MMPs等[3，27]。在治疗早期，通过SASP，衰老细胞可以旁分泌诱导邻近细胞衰老，起到阻止肿瘤生长的屏障作用。且SASP由多种趋化因子和细胞因子组成，可激活免疫监视，并带来先天性和适应性免疫反应，清除衰老和增殖的肿瘤细胞，增强衰老对肿瘤的抑制能力。
但随着衰老细胞的增多以及衰老进程的加速，持续激活的SASP信号可能反过来促进肿瘤的发生和发展。SASP中有多种炎性因子，过量释放的炎性因子可能引起局部和全身的炎症，促进多种疾病发展（包括肿瘤），引起患者不良预后[28-29]。SASP中的多种因子有促肿瘤的特性，如MMP3可以促进肿瘤侵袭；
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可以促进肿瘤血管生成。SASP的持续激活还能重塑肿瘤微环境，促进肿瘤发生发展，引起GBM复发[30]。在异种移植小鼠模型中，与仅注射未照射的对照细胞相比，联合注射经照射的、衰老的原代GBM细胞和未照射的GBM将产生更大的、侵袭性更强的肿瘤块[31]。另外，研究发现，当衰老细胞出现在疾病后期时，SASP会抑制免疫监视，帮助衰老逃逸，从而促进肿瘤复发和转移[3]。
衰老和SASP在肿瘤治疗中是一把双刃剑，如何更好地发挥TIS在肿瘤治疗中的抑癌作用而避免其促癌作用，是目前完善肿瘤治疗方案的关键。衰老细胞的持续存在和SASP的负面作用是主要问题，因此多项研究开始聚焦于选择性清除衰老细胞或减少衰老细胞的产生，衰老消融剂（senolytics），是一类选择性清除衰老细胞的药物[32-33]，包括靶向性小分子化合物和天然化合物。
5.1 BCL-2蛋白家族抑制剂
细胞在治疗压力下发生衰老，相较于发生凋亡这种直接的细胞死亡，是一种更温和的细胞反应。此时细胞虽周期停滞，但仍保持较高的代谢水平和细胞活力[14]。实际上，凋亡抗性是衰老细胞的特征之一，可能有助于它们在衰老组织和化疗后积聚。NF-κB在衰老细胞中被激活，诱导抗凋亡因子产生，抑制肿瘤细胞凋亡，保持细胞活力和代谢。BCL-2蛋白家族，包括Bcl2、BclW、Bcl-XL和Mcl-1，在细胞死亡相关过程（包括自噬和凋亡）中起核心作用，在衰老细胞中表达上调[34]；
因此，针对这些蛋白的化合物作为衰老消融剂被广泛研究。研究显示，BCL-2家族抑制剂显示出缓解年龄相关疾病（如肿瘤）的潜力[33]。ABT-737是最早发现的BclW/Bcl-XL抑制剂之一，它能在体内和体外优先诱导衰老细胞的凋亡[35]。然而，ABT-737的口服利用度较低，于是一种可口服类似物ABT-263（Navitoclax）被开发出来，并作为第一代Bcl2/Bcl-XL抑制剂进入临床试验[36]。无论是替莫唑胺还是辐照诱导的衰老GBM细胞系，都可以被ABT-263选择性地清除[14]。实验揭示，当对C57BL6/J小鼠辐照一段时间后再移植肿瘤，与对照组相比，预先使用ABT-263消除衰老细胞的小鼠肿瘤生长更慢，存活期更长[22]。
5.2 p53再激活
p53是一种常见的肿瘤抑制蛋白，激活的p53会诱导细胞周期停滞在G1、G2和S期，以便基因组DNA在合成受损时有时间修复自己，从而防止异常细胞增殖和保护癌基因应激的基因组完整性[37]。恢复细胞核内p53的水平被认为是治疗多种癌症的潜在方法，包括GBM[38]。小鼠双微体扩增基因2（mouse double minute 2，MDM2）诱导p53降解，其抑制剂可以有效恢复p53水平，尽管这种作用仅在具有MDM2扩增和突变型TP53的GBM（8%～10%）中有效[38]。FOXO4（Forkhead box protein O4）可以螯合p53以促进周期停滞并阻止其引发细胞凋亡[39]。实验发现，使用细胞穿透性阻断肽可以从FOXO4中解离p53，使之重定位到线粒体，继而引起半胱天冬酶依赖性凋亡[40]。但FOXO4-p53干扰是否能在GBM中起作用仍有待验证。
5.3 HSP90抑制剂
热休克蛋白90（heat shock protein，HSP90）是一种常见的分子伴侣，已被证明在包括GBM在内的多种癌症中发挥着促肿瘤的作用[41]。2017年，HSP90抑制剂首次被发现能作为一种衰老消融剂杀伤衰老癌细胞[42]，其机制是抑制HSP90对客户蛋白的稳定作用，从而抑制客户蛋白的促衰老癌细胞存活信号。HSP90抑制剂作为抗GBM药物已被广泛研究，但这主要是基于其在抑制GBM细胞活力和增殖方面的作用，其在GBM中清除衰老细胞的作用目前还没有报道。根据现有证据，我们有理由认为HSP90抑制剂可以作为替莫唑胺的辅助药物，改善临床治疗效果。
5.4 活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除剂
ROS水平升高对于诱导和维持细胞衰老状态具有潜在的关键作用[43]。放化疗通常引起肿瘤细胞和基质细胞DNA损伤，导致ROS等自由基水平增加，进而引起氧化应激反应，进一步导致衰老发生。高水平的ROS可直接作用于DNA，触发DNA损伤反应及激活NF-κB、MAPK等通路，引起衰老。ROS还可能促进肿瘤的上皮-间充质转化过程和干性的获得，促进肿瘤发生发展[44]。研究发现，与对照组细胞相比，使用替莫唑胺诱导衰老后的细胞中ROS水平显著上调[4]。清除ROS、NO等自由基，降低氧化应激反应可能是减少衰老细胞产生，改善GBM治疗效果的有效手段。
5.5 天然化合物
几种植物来源的天然化合物也展示出有效清除衰老细胞的作用，且这些化合物具有低毒性的优势，表现出转化为临床药物的巨大潜力[32]。达沙替尼是已被美国FDA批准用于治疗白血病的药物，是一种酪氨酸激酶抑制剂，它可以通过选择性抑制Src激酶促进肾上腺素受体依赖的细胞凋亡[32，45]。当达沙替尼和槲皮素（一种天然类黄酮）联合使用时，可以有效杀死衰老细胞，缓解小鼠早衰症状，改善年龄相关疾病，如阿尔茨海默病[32，45]。非瑟汀（fisetin）是一种存在于多种蔬菜和水果的天然类黄酮，新的一项研究揭示非瑟汀可以有效降低替莫唑胺诱导的衰老细胞数量。同样作用的还有青蒿琥酯，一种青蒿素的半合成衍生物。姜黄素作为衰老清除剂的相关研究也有很多，其已被证明在脑相关疾病和癌症中发挥有益作用。白藜芦醇也被证明可通过加强替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞衰老来起作用[14]。此外，白藜芦醇和其他多酚能够抑制ROS的形成并限制神经元中的细胞衰老[45]，从而减少衰老基质细胞对GBM的促进作用。
抗衰老治疗的相关靶点总结见表1。
表1 抗衰老治疗在GBM中的潜在靶点Tab 1 Potential targets for anti-senescence therapies against GBM
随着对肿瘤发生发展认识的逐步加深，细胞衰老在肿瘤治疗中的负面影响逐渐引起研究者的重视，尤其是持续存在的衰老细胞。GBM具有高度可塑性，在治疗压力下可能发生表型转变，逃逸衰老后引起更恶性的复发肿瘤；
且TIS引起肿瘤和非肿瘤细胞的分泌表型改变，可能建造促肿瘤生长的微环境，诱导残留病灶复发，给GBM的治愈造成极大的困难。目前，抗衰老治疗在GBM中存在较多空白，相关药物是否安全有效有待进一步研究。了解不同类型的衰老及其在残留病灶中的作用，以开发抗衰老疗法来对抗化疗和放射治疗引起的耐药性，是未来治疗GBM，提高患者生存率有希望的途径。
