王俊杰 林枫 吴润龙 胡炎辉 陈燕川 李谊军 周宇 李林霜 田景全 张智征 蒋颖 白芸 张晋鹏 肖瑞平 冯丽爽 程和平 王爱民
关键词：化妆品检测；
医美评估；
双光子显微镜；
皮肤成像
传统的皮肤病理检测通常需要切取一定大小的皮肤组织制作成病理切片，经过HE染色处理，然后用显微镜成像观察。这种离体成像方式有创且耗时长，因此大量的研究者致力于研发无创、在体、实时、无标记的成像技术。双光子显微成像技术便是其中之一[1]。这是一种将双光子吸收、激发原理和激光扫描共聚焦显微成像技术两者相结合的成像技术。因其具有穿透深度大、层析成像能力强、可激发外源与内源性荧光团、亚微米级分辨率等诸多优点，自问世以来，就成为生物医学领域非常重要的一种成像技术[2]。生物组织中的内源性荧光团，如NADH（Nicotinamideadeninedinucleotide，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、FAD（Flavinadeninedinucleotide，黄素腺嘌呤二核苷酸）、胶原纤维、弹性纤维、黑色素、角蛋白等，都能实现有效地双光子激发[3]。双光子成像不仅能够提供形态学信息，还能提供光谱信息，这对于临床辅助诊断、医美早中期疗效评价、护肤品检测等，具有重大的潜在应用价值。
然而目前双光子显微成像技术所使用的成像组件的体积大，人机工程学设计欠佳，导致在临床使用上检查部位受限；
且由于内部空间光路结构复杂精密，导致其稳定性和可靠性较差。因此，我们研发了一款便携的手持式双光子显微镜，由主机和手柄两部分组成，主机和手柄用柔性光电复合线缆连接，便于握持的手柄设计方便操作人员对被测者全身各个部位进行快速檢查，从而可对人体皮肤进行高时空分辨在体三维双光子显微成像。
01原理方法和设备
1.1双光子成像原理
双光子显微成像技术利用显微物镜将百飞秒量级的近红外激光脉冲聚焦至样本内，在焦点处的荧光分子发生双光子吸收而跃迁至高能级，在返回基态的过程中放出荧光光子。在扫描系统的控制下，激光对样本进行X、Y、Z三轴扫描，记录每一个像素点的灰度值信息，从而实现3D层析成像。除了上述双光子荧光（TPEF）过程外，成像过程中还会发生其他非线性效应，例如二次谐波（SHG）、三次谐波（THG）、三光子荧光（3PEF）等。只要选择合适的激光参数，并调整相应的探测波段，就能够实现多模态的多光子显微成像。
1.2皮肤的结构与内源性荧光团分布
皮肤是人体最大的器官。人的表皮，除了手掌和掌跎部位以外，由浅至深可分为角质层、颗粒层、棘层和基底层，再往深便是真皮层[4]。角质层由细胞核和细胞器消失的角质细胞和细胞间质构成，富含角蛋白，具有强烈的TPEF信号；
颗粒层由1～3层扁平或菱形细胞所组成，胞质内部有少量线粒体（富含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH）、黑素颗粒等荧光团，TPEF信号很弱；
棘层由4～8层多角形细胞组成，棘细胞胞质内有许多线粒体和少量黑素颗粒，具有较强的TPEF信号；
基底层为一层柱状或立方状的基底细胞，其胞质内含有许多线粒体，核的上方通常有排列成帽状的黑素复合体，具有较强的TPEF信号。再往下是真皮浅层，富含胶原纤维和弹性纤维。胶原纤维成束存在，直径在2-～15μm之间，由胶原原纤维组成；
胶原原纤维由胶原分子聚合平行排列而成，并形成周期性横纹，因而能够产生SHG信号。弹性纤维直径为1～3μm，缠绕在胶原束之间，也具有较强的TPEF信号。由于表皮组织对近紫外至近红外的光具有强烈的散射作用，皮肤的双光子成像深度通常不超过200～250μm，这个深度能够覆盖大多数部位皮肤的表皮，到达真皮浅层处。
1.3仪器设计
手持式双光子显微镜如图1所示。位于主机里的掺铒锁模激光器产生的飞秒激光脉冲经光纤沿主机与手柄之间的线缆传输到手柄中的微型化双光子显微成像探头。在探头中，激光经过两个反射镜后入射微机电（MEMS）扫描振镜，该MEMS扫描振镜可以栅格扫描方式支持9fps@512×512像素的帧率，扫描视场大小约为140μm×140μm。整个探头的轴向运动由一个线性位移台控制，可对样本进行300μm以上厚度的层切扫描。飞秒激光被数值孔径为0.9的物镜聚焦到样本上，样本被激发产生的信号被收集到一根玻璃光纤束中，并沿主机与手柄之间的线缆传输回到主机中的光探测模块。该模块由TPEF通道（420～580nm）和SHG通道（375～410nm）构成，分别探测双光子荧光信号和二次谐波信号。每个像素的信号强度存储为16位灰度值，并由基于ZYNQ主控板和上位机的控制软件进行处理，重构出扫描的图像。显微镜使用了数值孔径为0.9浸没介质为硅油或者硅凝胶的物镜，实现了小于0.6μm的横向分辨率和小于3.0μm的轴向分辨率，如表一所示。
1.4操作流程
1）接通电源，开启主机，开启上位机软件，等待系统启动完成；
2）输入被测者信息；
3）打开手柄保护盖，将手柄前端的成像探头保护窗片用医用消毒酒精擦拭，清除窗片表面杂质的同时，对手柄前端与皮肤直接接触的部位作消毒处理；
4）用湿巾润湿和擦拭待测部位皮肤，并用干纸巾拭干；
5）将探头对准并贴住皮肤，操作上位机软件即可实时观察双光子成像结果；
6）成像完毕，清洁手柄和探头，盖上探头保护盖，放置好手柄；
7）关闭上位机软件，关闭主机。
02结果
2.1皮肤的3D扫描成像
我们对皮肤状况正常的某位志愿者（男性，34岁，171cm，68kg，皮肤Fitzpatrick分型为III-IV型）的前额、脸、胸、腹、腰、前臂、大腿等部位进行了3D扫描成像。成像时，仅对被测部位皮肤进行简单清洁和润湿。成像及程序参数为：图像分辨率设为512×512，帧率为9fps；
以2μm、3μm或5μm为步距；
每层拍摄20帧并以灰度平均的方式叠加为1帧；
双通道各自存储原始数据，并将TPEF通道数据赋予红色伪彩、SHG通道数据赋予绿色伪彩后以RGB格式合成伪彩图像进行展示。
2.2图像分析与指标计算
成像结果如图2所示，表皮的各层角质形成细胞以及真皮浅层的弹性纤维与胶原纤维等清晰可见，且呈现出一些有趣的特点。例如，前额的角质形成细胞分布更为平坦，真表皮交界起伏较小，胶原纤维呈条状；
面部皮肤的弹性纤维和胶原纤维含量非常丰富，呈明显的网状分布；
胸、腹、腰部位皮肤的呈蒙古包形状的基底细胞将富含弹性纤维与胶原纤维的真皮乳头包裹覆盖，在层切成像模式下，呈现典型的真皮乳头形态。前臂和大腿部位的皮肤，真皮乳头的尺寸比前面这些部位的尺寸都要大。
根据图2中的成像结果，可以计算得到包括表皮厚度、SAAID（SHGtoAutofluorescenceAgingIndexofDermis，由二次諧波与自发荧光定义的真皮老化指数）等在内的指标。图2中的“前臂”数据的YZ视图如图3所示。图中标注了该处的表皮厚度为30μm。方框所选深度区域内计算得到的SAAID平均指数为SAAID=（SHG-TPEF）/（SHG+TPEF）=0.28。采用同样的方法处理图2中的其他数据，得到表皮的厚度在20～100μm不等，表明不同部位皮肤的表皮厚度差异较大，且真表皮交界存在明显的起伏。
03讨论
双光子显微镜通过逐层扫描成像，可以重构出被测区域皮肤的3D结构，获得皮肤的三维形貌特征，例如角质层厚度、表皮厚度、真表皮交界、皮沟深度等。其荧光通道能清晰地区分出细胞质、细胞核，观察到线粒体的分散与聚团，弹性纤维的密度和网络的构成方式等；
二次谐波通道则能观察到胶原纤维的分布情况；
通过胶原的出现与否，可判断成像深度是否到达真表皮交界部位，便于对基底层的准确定位。另一方面，由于双光子荧光信号来源于分子的荧光，其信号强度正比于发光物质的浓度，因此双光子显微镜还可以进行功能成像，例如在体检测角质形成细胞的耗氧率[5]、测量皮肤的SAAID/ELCOR指数[6]、检测动脉阻断再灌注过程中的荧光上升速率与下降速率等。
手持式双光子显微镜的用途远不止于皮肤成像。作为一台通用的双光子显微镜，它可以被用来观察离体样本，对动物、植物进行活检，直接观察培养的细胞、微生物等。另外，利用相同的手持探头技术，只需开发出相应波长的小型化飞秒激光器，即可成为一台相应波长的手持式双光子显微镜，用于观察各种内源性的和外源性的荧光和高次谐波产生。
04结语
便携的手持式双光子显微镜，可实现以往只能在台式双光子显微镜或可移动台式双光子显微镜才具有的技术优势。仅重12kg的手持式双光子显微镜的研发，为广大与皮肤相关的科研工作者、医生、美容和化妆品行业从业人员提供了一种便捷的选择，能够随时随地实现“在体、原位、无创、无标记”的高时空分辨率双光子显微成像，在皮肤疾病辅助诊断、化妆品功效检测、医美评估领域具有广阔的应用前景。
