邹尚浏，刘昌权，陈祝明，叶亲永，李益丰，郭庭余，杨宇宁，刘思景 （广东医科大学附属第二医院创伤骨科,广东湛江 524003）
骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有较高的致残率和致死率[1]。随着手术、新辅助化疗和重建材料等技术的发展，骨肉瘤患者总生存率从 20% 显著提高到70%，且保肢治疗已成为骨肉瘤的主要治疗策略[1-2]。然而随着治疗周期延长、药物毒性及耐药等情况出现，患者的化疗效果受到极大影响。因此寻求一种安全且具有抗骨肉瘤作用的药物显得尤为重要。Tagitinin D（1-Acetyltagitinin D）属倍半萜内酯类天然小分子化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等作用[3-5]。目前有关Tagitinin D 在骨肉瘤中的作用机制仍未明了，因此，本研究以人骨肉瘤 MG63 细胞为研究对象，观察Tagitinin D 对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，旨在了解其抑制肿瘤的发生机制，为开发并利用Tagitinin D 的药用价值提供参考。
1.1 材料
人骨肉瘤MG63 细胞株（中国科学院上海细胞库），胰蛋白酶、胎牛血清、高糖DMEM 培养基和100×青/链霉素（Gbico，美国），Tagitinin D（云南西力生物技术有限公司，纯度 99%），MTS（Promega，美国），AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（BD，美国），细胞周期检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司，PRO-PREP Protein Extraction Solution（iNtRON Biotechnology，韩国），PVDF 膜（Millipore，美国）、发光液（Thermo scientific，美国），一抗、二抗稀释液（上海碧云天生物技术有限公司，中国），兔抗Bax、Bcl-2、GAPDH 单克隆抗体（Cell Signaling Technology，美国），二抗羊抗兔及羊抗鼠（Santa Cruz，美国），BD FACSCanto II 流式细胞仪（BD，美国），BX51 免疫荧光显微镜（OLYMPUS，日本）。
1.2 方法
1.2.1 细胞形态学观察 取对数生长期MG63 细胞接种于10 cm2培养皿中，待细胞融合达80%后（细胞数约1.0×107个），用不同浓度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）处理细胞24 h，光学显微镜记录细胞形态学变化。
1.2.2 MTS 检测Tagitinin D 对人骨肉瘤细胞MG63增殖的影响 取对数生长期MG63 细胞接种于96 孔板中，待细胞贴壁后（细胞数约1.0×105个），更换含不同浓度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）完全培养基，分别处理12、24、48、72 h 后，收取样本，结合MTS 试剂盒说明书进行操作，酶标仪测定吸光值（492 nm），每一浓度设置5 个复孔。计算细胞增殖抑制率[6]，抑制率（IR）=（对照组吸光值-实验组吸光值）/对照组吸光值×100%。
1.2.3 流式细胞术PI 染色检测细胞周期 取对数生长期MG63 细胞接种于6 孔板中（细胞数约2.5×106个），培养24 h 后，用不同浓度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）处理细胞24 h，离心后加入75%乙醇，消化混匀重悬后，4 ℃固定过夜。再次离心收集细胞，预冷PBS 洗涤后离心，200 μL PBS 重悬混匀细胞后加入20 μL RNase A Solution，37 °C 水浴孵育30 min，400目筛网过滤后加入400 μL PI 染色液轻轻混匀，4 °C 避光孵育30 min，流式细胞仪上机检测。
1.2.4 AnnexinV-FITC/PI 双染检测细胞凋亡 取对数生长期的MG63 细胞接种于6 孔板中，细胞数约2.5×106个，培养细胞贴壁后，用不同浓度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）处理，收集上清液，胰酶消化贴壁细胞，离心10 min，预冷PBS 漂洗，Binding Buffer重悬，调整细胞浓度为1×106个/mL，同时选取100 μL细胞悬液至流式管中，混匀，加入FITC-Annexin V 和PI 溶液，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测[6]。
1.2.5 细胞免疫荧光染色 将MG63 细胞接种于预置盖玻片的12 孔板中，待细胞完全贴壁后，用不同浓度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）处理MG63 细胞24 h 后收集爬片，固定后用0.1% Triton X-100/PBS 摇床透化10 min，滴加DAPI 覆盖爬片，避光孵育30 min，封片，倒置荧光显微镜采集图像[6]。
1.2.6 Western-blot 检测细胞凋亡相关蛋白表达 取对数生长期MG63 细胞（细胞数约1.0×107个）接种于10 cm2培养皿中，细胞贴壁后，用不同浓度Tagitinin D（0、10、20、40 μmol/L）处理MG63 细胞24 h，收集贴壁和悬浮细胞，离心10 min 后去上清液，Proprep 蛋白裂解液提取细胞蛋白，SDS-PAG 电泳后将蛋白电转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭，摇床孵育2 h，加入一抗4 °C 过夜后，加入二抗，室温孵育2 h。image J 软件分析蛋白条带灰度值[6]。
1.3 统计学处理
采用Graphpad Prism 7.0 软件进行统计，结果数据以表示，组间比较采用单因素方差分析及Dunnett检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。
2.1 Tagitinin D 对MG63 形态学的影响
与0 μmol/L Tagitinin D 比较，10、20、40 μmol/L Tagitinin D 细胞形态出现胞质皱缩，部分细胞体积缩小、变形和脱落漂浮（已去除），贴壁细胞间隙变大，且随Tagitinin D 剂量增加变化越明显，见图1。
图1 不同浓度Tagitinin D 处理MG63 细胞24 h 后形态变化（×100）
2.2 Tagitinin D 对MG63 细胞增殖的影响
根据酶标仪检测吸光度值计算出 Tagitinin D 作用于 MG63 细胞的IC50 值为（28.33±1.25）μmol/L。同一时间点，MG63 细胞的生长抑制率随Tagitinin D浓度增加而升高（P＜0.05 或0.01），见表1。
表1 Tagitinin D 对MG63 细胞增殖的影响 （，n=5 ）
表1 Tagitinin D 对MG63 细胞增殖的影响 （，n=5 ）
同一时间点与0 μmol/L Tagitinin D 比较：aP＜0.01，bP＜0.05；
与10 μmol/L Tagitinin D 比较：cP＜0.01；
与20 μmol/L Tagitinin D 比较：dP＜0.01
2.3 Tagitinin D 对MG63 细胞周期的影响
随着Tagitinin D 浓度升高，G0/G1 期细胞比例下降，G2/M 期和S 期细胞比例升高（P＜0.05 或0.01）；
当Tagitinin D 浓度达40 μmol/L，可同时阻滞MG63 细胞G2/M 期和S 期进展（P＜0.05 或0.01）。见图2 和表2。
表2 Tagitinin D 作用MG63 细胞24 h 后细胞周期分布 （，n=5）
表2 Tagitinin D 作用MG63 细胞24 h 后细胞周期分布 （，n=5）
同一时期与0 μmol/L Tagitinin D 比较：aP＜0.01；
与10 μmol/L Tagitinin D 比较：bP＜0.01，cP＜0.05；
与20 μmol/L Tagitinin D 比较：dP＜0.01
图2 PI 单染法检测Tagitinin D 对MG63 细胞作用24 h 后周期分布
2.4 细胞免疫荧光染色观察Tagitinin D 对MG63 细胞凋亡的影响
与0 μmol/L Tagitinin D 比较，10、20、40 μmol/L Tagitinin D 处理组中的细胞稀疏、细胞间隙增大、细胞核固缩等，细胞凋亡比例随Tagitinin D 浓度的增高而增多，见图3。
2.5 Tagitinin D 对MG63 细胞凋亡的影响
随着Tagitinin D 浓度的增加，促凋亡蛋白Bax 的表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达降低（P＜0.05 或0.01），见图4 和表3。
图4 Tagitinin D 对MG63 细胞凋亡相关蛋白表达水平的变化
表3 调亡相关蛋白条带灰度值比 （，n=5）
表3 调亡相关蛋白条带灰度值比 （，n=5）
与0 μmol/L Tagitinin D 比较：aP＜0.01；
与10 μmol/L Tagitinin D 比较：bP＜0.01；
与20 μmol/L Tagitinin D 比较：cP＜0.01，dP＜0.05
骨肉瘤是一种罕见的高度异质性、恶性骨肿瘤，具有侵袭力强、预后差等特点。目前，临床上治疗骨肉瘤的方式主要以化疗为主同时辅以其他综合治疗。而在骨肉瘤化疗过程中使用的大剂量化疗药物具有一定的毒副作用，化疗周期较长，并且容易导致细胞耐药性增加，影响疾病治愈效果[6-7]。由于抗癌药物存在的局限性，天然小分子化合物及其衍生物为抗癌新药的研发提供了新的思路。有研究表明抗癌药物中一半来源于天然产物及其衍生物[8]。因此，研究具有高效且低毒的药物是治疗骨肉瘤的有效途径之一。本文主要从周期阻滞等方面研究Tagitinin D 诱导人骨肉瘤细胞凋亡的作用机制。
本实验中，我们首先用MTS 法检测Tagitinin D 诱导人骨肉瘤MG63 细胞活力的情况，结果提示在同一时间点，MG63 细胞的生长抑制率随Tagitinin D 浓度的增加而升高，说明Tagitinin D 能显著抑制MG63 细胞的活力，从而达到抑制肿瘤细胞增值的可能。
细胞周期中的每一时相顺利转变是细胞进行有丝分裂的关键。Tagitinin D 在MG63 细胞中产生了G2/M 期和S 期相停滞，引起细胞凋亡。本研究发现，随着Tagitinin D 浓度的升高，MG63 细胞G2/M 期和S期细胞比例明显增加，表明Tagitinin D 可能通过阻滞MG63 细胞G2/M 期和S 期进展抑制细胞增殖。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序性死亡，主要表现在细胞染色质凝集并边缘化、细胞浓缩、凋亡小体产生等[9]。我们通过免疫荧光染色发现Tagitinin D 可导致MG63 细胞核固缩、细胞间隙变大，提示Tagitinin D 可能诱导MG63 细胞凋亡。
细胞凋亡是细胞发育的重要调控机制，主要通过外在和内在的细胞凋亡两种途径进行[10]。第一种途径是内源性或线粒体途径，其通过促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2 家族介导；
第二种途径是通过FAS 死亡受体介导的外在细胞凋亡途径或细胞质途径[10-11]。在调控凋亡基因中，Bcl-2 家族主要引起内在细胞靶向抗凋亡，与凋亡的发生、发展最为密切[11]。Westernblot 检测结果分析，促凋亡蛋白Bax 表达量呈Tagitinin D 浓度依赖性增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 呈Tagitinin D 浓度依赖性下调。本研究中我们通过蛋白质印迹法证实Tagitinin D 可能通过上调Bax 和下调Bcl-2 蛋白表达诱导MG63 细胞凋亡，这些结果可能进一步支持了Tagitinin D 通过Bcl-2 家族蛋白调控诱导细胞凋亡。
综上所述，本研究在细胞层面证实了Tagitinin D对人骨肉瘤细胞MG63 的增殖具有明显的抑制作用，可通过改变MG63 细胞中Bax、Bcl-2 蛋白表达的平衡阻滞细胞周期进展，引发细胞凋亡。
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