何 茜，王大华
中国矿业大学附属医院 1皮肤科 2耳鼻喉科，江苏徐州 221002
皮肤是身体占比最大的器官组织，由真皮层和表皮层紧密结合形成。真皮层存在丰富的胶原蛋白和成纤维细胞，构成致密的结缔组织；
表皮层分布着多边形细胞、梭形细胞、无核扁平细胞，以及黑色素母细胞等多种细胞[1]。早期电子显微镜研究显示，皮肤组织存在广泛的间隙连接(gap junction，GJ)，通过GJ连接相邻细胞的细胞质，完成组织中亲水小分子(相对分子质量低于1500)直接细胞间交换转移，例如：谷胱甘肽、葡萄糖、谷氨酸、ATP、cAMP、离子(如Ca2+、K+、Na+、Cl-)，以及其他细胞代谢物和第二信使等，维持皮肤屏障稳态[2]。以此构建的细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication，GJIC)在多种生理代谢过程中发挥着重要作用，包括细胞分化、增殖和炎症反应等，是维持组织动态平衡、跨细胞电信号和代谢信号传导的关键调控点[3]；
同时，由于表皮层并无血管组织，进一步凸显出GJ的GJIC在确保内层和外层之间的正确信号传递过程中的重要性。
GJ的主要成分是一组高度保守的跨膜蛋白——间隙连接蛋白(connexin，Cx)。目前在人类中共发现21种Cx蛋白，在小鼠中发现20种。颗粒层中主要表达Cx30、Cx30.3、Cx31和Cx45；
Cx26和Cx31.1主要表达在发生层；
而Cx43在表皮和真皮层中均有广泛表达。此外，Cx43还直接参与表皮层和真皮层细胞的增殖和迁移活性调控，是伤口愈合、皮肤角质化及皮肤肿瘤发展等生理病理过程的重要调控节点[4]。本文将重点介绍Cx43在皮肤屏障稳态中的作用、Cx43基因突变临床伴发疾病及其潜在致病机制研究进展。
Cx43蛋白结构Cx43由GJα1基因(gap junction α 1，GJA1；
MIMno.121014)编码，其表达在转录和转录后水平调控。Cx43的5′端侧翼启动子中存在1个激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)和2个特异性蛋白1转录因子(specifity protein 1 transcription factor，SP1)结合位点；
蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和雌激素通过AP-1和SP1位点调控Cx43转录；
Wnt信号转导和蛋白酶激活受体1(protease-activated receptor-1，PAR-1)也能上调Cx43转录水平[5]。C端是Cx43转录后调控区域，该区域包含多个磷酸化位点，也是Cx43的主要功能域。肿瘤生长促进因子、蛋白激酶和炎症细胞因子，如PKC、Src激酶、酪蛋白激酶1和蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，可通过C端的丝氨酸/酪氨酸残基调节Cx43磷酸化水平，进而调节Cx43的亚细胞定位和GJ通道装配[6]。
Cx蛋白先以6个单体聚合形成同源异构体(由相同类型Cx组成)或异源异构体(由1种类型以上Cx组成)半通道；
半通道再与毗邻细胞表面半通道对接，共同构成由相同2个半通道类型组成的同型GJ通道，或包括不同半通道类型的异型GJ通道[7]。异源通道的每种组合赋予其独特的信号传导特性，不同类型通道的功能受到Cx蛋白相容性的限制，决定了小分子在细胞间传递必遵循不同的递送途径。
Cx43亚基共有4个疏水性跨膜结构域、2个细胞外环、1个胞质环，以及1个胞质N-末端和1个C-末端区域(图1)。在GJ通道装配过程中，6个Cx43亚基在质膜中形成1个半通道，并与相邻细胞质膜中的另一个半通道对接[8]。
图1 人类Cx43(编号：P17302)蛋白拓扑结构示意图，使用 Protter 蛋白质可视化在线工具(http：//wlab.ethz.ch/protter/start/)绘制
Cx43蛋白在皮肤组织中的生理功能近期研究结果表明，Cx43直接参与角质形成细胞和成纤维细胞的增殖和迁移活性调控，直接影响伤口愈合、皮肤过度角质化及皮肤肿瘤发展等过程。
在皮肤伤口愈合过程中，伤口部位的高浓度cAMP通过下调Cx43表达水平，破坏细胞连接，引起细胞骨架重塑。活化的AKT在S373处使Cx43蛋白磷酸化，限制Cx43与紧密连接蛋白(zonula occludens-1，ZO-1)间的相互作用，最终诱导皮肤中角质形成细胞的活化和迁移。小鼠模型研究结果显示，与 WT 组小鼠相比，Cx43+/-小鼠的伤口愈合效果有显著改善，受伤后第 5 天的红斑和渗出物更少，第 11 天的伤口回缩更明显[9]；
进一步研究证明，Cx43缺失会诱导真皮成纤维细胞的增殖和活化[9]，并通过上调Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-2和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，增强胞外基质形成[9]。此外，Cx43敲减还可能通过下调肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达水平，上调TGF-β1和胶原α1的表达，影响中性粒细胞和巨噬细胞迁移，调节炎症反应水平[10]。
Cx43的作用不仅仅是简单地形成GJ通道，也通过蛋白相互作用稳定一系列蛋白质(图2)，如N-钙黏蛋白(N-cadherin，N-cad)和ZO-1，在细胞-细胞黏附和细胞迁移等过程中发挥重要作用[6]；
同时，Cx43的表达水平和活性也受到严格调节。在黑色素瘤侵袭过程中检测到Cx43表达上调及E-钙黏蛋白表达减少；
作为PAR-1的下游效应因子，Cx43还介导黑色素瘤转移和肿瘤微环境适应[11]。Cx43在黑色素瘤中的作用暗示其可能作为癌基因发挥作用，Cx43有望作为恶性/侵袭性黑色素瘤分化程度和治疗预后生物标志物。但在非黑素瘤皮肤癌——基底细胞癌(basal cell carcinoma，BCC)和鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)组织中无法检测到Cx43表达，导致在BCC和SCC中仅形成少量GJ通道[12]。推测Cx43可能阻止BCC和SCC的恶性生物学转移和侵袭。这种Cx43在不同皮肤癌中迥异的调控机制还有待深入研究。
APC：腺瘤样结肠息肉癌蛋白；
ARRDC3：含抑制结构域的蛋白3；
AXIN1：轴蛋白-1；
AXIN2：轴蛋白-2；
BCL9：B细胞急性淋巴瘤9蛋白(转录共激活剂)；
CBL：卡西塔斯b系淋巴瘤蛋白(E3泛素蛋白连接酶)；
CDH1：钙黏蛋白1；
CDH2：钙黏蛋白2；
CDH3：钙黏蛋白3；
CGN：扣带蛋白；
CREBBP：CREB结合蛋白；
CRK：富含半胱氨酸的类受体激酶；
CTNNA1：连环蛋白α-1；
CTNNB1：连环蛋白β-1；
DBN1：脑发育调节蛋白 1；
EGFR：表皮生长因子受体；
EP300：组蛋白乙酰基转移酶p300；
EPS15：表皮生长因子受体途径底物15；
ERBB2：erb-b2受体酪氨酸激酶2；
GJA1：缝隙连接α-1蛋白；
GSK3B：糖原合成酶激酶-3β；
IQGAP1：IQ结构域GTP酶激活蛋白1；
KHDRBS1：含KH的RNA结合结构域信号转导相关分子1；
LEF1：淋巴增强子结合因子1；
LRP5：低密度脂蛋白受体相关蛋白5；
NEDD4：神经元表达发育下调蛋白4(E3泛素蛋白连接酶)；
PELP1：富含脯氨酸、谷氨酸和亮氨酸的蛋白；
PGR：孕激素受体；
PITX2：成对的同源域转录因子2；
PKP2：吡咯菌素2；
PXN：桩蛋白；
RUVBL1：ruvb样AAA(与多种细胞活性相关的ATP酶)ATP酶1；
SCN5A：钠通道蛋白5型亚基；
SKP1：s相激酶相关蛋白1；
SRC：Src原癌基因酪氨酸蛋白激酶；
STAT3：信号换能器和转录激活器；
TBL1X：含F-box样/WD重复序列的蛋白；
TCF7L1：转录因子7-样1；
TJP1：紧密连接蛋白ZO-1；
UBQLN4：泛激素-4；
VCL：黏着斑蛋白。
眼齿指发育不良迄今为止已证实GJA1基因中的110多个位点突变与眼齿指发育不良(oculodentodigital dysplasia，ODDD)相关，其中大多数突变是染色体显性无意突变(约88%，HGMD数据库)。其临床表型包括诸多方面：青光眼，典型的颅面异常，耳鼻异常和小头症，牙釉质发育不良，牙根不规则，颌骨、手脚发育畸形，心律失常等；
除了在大多数ODDD患者中发现的这些共同病症之外，患者还可能表现出多种并发症，包括中枢神经系统缺陷、智力迟钝、膀胱失禁、皮肤疾病等[13-14]。由于Cx43在绝大多数人体组织中均高水平表达，同时还存在110多个突变位点，因此这或许是在ODDD病例中涉及多种身体器官的原因之一。
为阐明ODDD突变体与临床表型之间的相关性，研究者建立了诸多转基因小鼠模型作为实验对象。这些研究表明，GJA1基因突变可通过至少10种不同的机制引起ODDD，这些机制主要分为功能丧失型或功能获得型突变。功能丧失型突变体包括那些不能正确运输到细胞膜，并在蛋白质分泌相关细胞器中无序聚集的突变体。例如：位于高度保守跨膜结构域——p.Leu26Pro和p.Ser27Pro两个相邻位置的脯氨酸突变，因为脯氨酸侧链的环状结构赋予了突变体更高的构象刚性，会破坏 α 螺旋和 β 折叠的二级结构，导致在蛋白质骨架中形成“扭结”，因空间位阻而与其他残基产生不稳定效应。此外，脯氨酸不具备形成氢键的能力，将进一步加剧二级结构的不稳定性[14]。功能获得型突变体中仍然能够组装成GJ通道，但是该通道并不再具备完整生物学活性，虽然功能获得型突变体也可正常转运定位至细胞表面，但只会组装成过度活跃的连接蛋白“半通道”。例如，Cx43 p.Gly138Arg 点突变的ODDD小鼠模型心肌细胞ATP 释放通道活性显著增强，形成跨膜泄漏，导致静息电位降低，加剧室性心律失常[15]。
可变性红斑角皮病可变性红斑角皮病(erythrokeratodermia variabilis et progressive，EKVP)是一种罕见的常染色体遗传性皮肤病，其特征是皮肤过度角质化，并伴随明显红斑病变，少数情况存在轻度牙釉质发育缺陷。病灶多发生于四肢、臀部和侧躯干的伸肌部位，病变在夏季趋于恶化，在冬季逐渐改善；
几乎有一半患者的手掌和脚掌皮肤明显增厚，导致掌跖角化[16]。
基因组学研究结果表明，在EKVP患者中可检测到GJB3、GJB4和GJA1基因存在突变；
GJA1E227D突变位于Cx43的第四跨膜结构域，是Cx43磷酸化以及与CIP150蛋白相互作用的功能域；
GJA1 E227D和A44V突变还会导致Cx43蛋白无法完成亚细胞定位，不能转运到细胞膜，而在高尔基体中聚集[16]。非洲爪蟾体外实验已证实，Cx43-A44v、Cx43-E227D cDNA 转染的卵母细胞仍然能够形成GJ通道，但与无法形成离子传导半通道的野生型相比，检测到更大的半通道电流[17]。类似情况在Cx26 突变的半通道活性增加导致的角膜炎-鱼鳞病-耳聋综合征(keratosis ichthyosis and deafness syndrome，KID)和掌跖角化病(palmoplantar keratoderma with deafness，PPK)研究中也有报道[17]。这种不同突变对半通道功能的共享增益表明，半通道活性增强可能是与皮肤病相关的共同特征。
鱼鳞病-少毛-白甲综合征鱼鳞病-少毛-白甲综合征(Keratoderma-hypotrichosis-leukonychia totalis syndrome，KHLS)是一种极为罕见的常染色体显性遗传疾病，其特征是严重的皮肤过度角化和先天性脱发。患者出生时便头发、眉毛和睫毛较稀疏，周身皮肤组织存在广泛过度角质化，可能在肘部、膝盖、耳郭和指关节周围区域发展出明显斑块，患者生活质量受到严重影响[18]。
通过外显子组测序，确定KHLS与GJA1 G8V突变相关；
电生理学实验结果显示，突变体半通道过度开放，Cx43半通道发生功能获得性增强，半通道活性过度活跃，细胞内Ca2+流过载，诱导皮肤角质形成细胞大量凋亡，最终致使患者皮肤发生严重角质化；
而通过补加外源Ca2+浓度以剂量依赖性方式挽救HEK293细胞凋亡[18]。
其他突变体的串扰除上述突变临床伴发疾病外，Cx43通过与Cx家族的其他成员相互作用而参与表皮角化调控异常过程。例如，Cx26蛋白的G12R/N14Y和H73R/S183F突变分别导致KID和PPK。在这些综合征中，Cx26基因突变体不能构成功能性通道，但与野生型Cx43蛋白相互作用显著增强，并明显提高Cx43半通道活性，Cx26突变体对Cx43有增益效果，提高了细胞膜的通透性，最终导致ATP渗漏和Ca2+过载[19]。
突变不影响GJ功能Gordana等[20]报道，在Cx43第2个细胞外结构域中构建的点突变——F199L、R202E和E205R无法准确定位到质膜，集聚于细胞质中，突变体细胞中的GJ通道也明显减少，但表达F199L、R202E 和 E205R 突变体，或野生型Cx43的C6 神经胶质瘤细胞和HeLa细胞均显示出较慢的生长速率。这表明，F199L、R202E 和 E205R 突变体抑制肿瘤细胞生长的能力与野生型相似。
在Cx30突变相关病例中有相似报道，Cx30 T5M是与非综合征性听力损失特异性连锁的Cx30突变体之一。Berger等[21]报道该突变体可以完成类似于野生型Cx30的功能性GJ通道和半通道组装[21]，会额外允许碘化丙啶、Alexa Fluor 350这一类大分子在哺乳动物细胞中转运，Cx30 T5M突变不影响GJ功能，但导致听力损失。推测可能有两方面原因：(1)证据表明Cx26和Cx30是协同调节，而Cx30与Cx26具有76%的序列同一性，容易形成异源GJ通道，Cx30 T5M突变可能改变了同型 Cx30-Cx30 和异型 Cx26-Cx30 通道的渗透性；
(2)Cx30参与了小鼠耳蜗细胞之间的葡萄糖摄取和代谢偶联，Cx30 T5M 可能通过调节代谢产物发挥作用。
突变部分降低GJ通道功能在转基因ODDD小鼠模型中，Cx43 I130T突变体与野生型Cx43相比，突变后GJ通道功能仅部分丧失，G60S突变体GJ通道功能完全丧失[22]，而I130T突变小鼠的乳腺没有表现出产奶或排奶缺陷[22]。表明就Cx43的部分偶合足以维持正常的乳腺功能，这也部分解释了为什么目前仍缺乏与ODDD患者相关泌乳缺陷病例相关报道。
突变体错误折叠GJ通道功能丧失fs230和fs260 Cx43突变体由于在蛋白翻译时无法正确折叠，成为异常蛋白质，也不能被转运至细胞膜，分别在内质网或高尔基体中形成规模性无序聚集，导致突变体GJ通道功能完全丧失，临床出现角质化不全[23]。在Vohwinkel/Bart-Pumphrey综合征中，Cx30 G59R突变体存在连接蛋白低聚缺陷，导致蛋白在高尔基体处堆积；
在与Vohwinkel综合征相关的Cx26 G59A和Cx26 D66H突变体中也出现相似情况[24]。
突变体GJ通道过度活跃已报道研究中，有两种机制能诱导Cx43突变体GJ通道活性增加：(1)Cx43自身突变导致GJ活性增加：在ODDD成纤维细胞系中，Cx43 G138R和Cx43 G143S突变体成纤维细胞均显示生长缓慢，迁移和细胞极化缺陷，而突变体GJ通道活性显著提高[25]，增加了ATP泄漏，破坏角质形成细胞内的Ca2+信号传导，导致皮肤组织角质化水平异常。(2)Cx43与家族中其他突变成员之间串扰，诱导Cx43 GJ通道活性提高：Cx26 N末端结构域突变，改变了Cx蛋白寡聚化兼容性，允许与 Cx43 的异源相互作用，并提高GJ通道活性，这些高活性异源半通道增加细胞膜通透性，导致细胞内ATP泄漏和 Ca2+过载，潜在地对邻近细胞产生不利影响，或诱导细胞凋亡[26]。
Cx是一类跨膜蛋白，半衰期在1～5 h间，表明细胞间的GJ通道具有很高的重组更替率，是实现高效率信号转导的物质基础。由Cx蛋白组成的GJ连接相邻细胞细胞质的跨膜通道，主要负责离子、代谢物和第二信使等在细胞间转递。这种细胞间通讯对细胞生长、增殖和分化、组织稳态、致瘤性、伤口愈合等生理或病理过程都至关重要。
Cx43是分布较为广泛的连接蛋白，迄今为止已经报道了70余种Cx43突变，并与多种疾病有关。而Cx43不但是多种损伤形式的初始响应者，Cx与上下游不同家族之间还存在紧密的调控关系，Cx43有希望成为具有较大运用价值的药物靶点。例如，以缓释凝胶的形式通过Cx43反义寡核苷酸或多肽，快速下调伤口边缘角质形成细胞Cx43水平，阻断通道功能并干扰Cx43相互作用蛋白，同时减少血管中的炎症反应，最终提高伤口愈合效果。结合Cx43结构生物学研究成果可以显著提高药物精确性。Cx43 C端是其转录后调控区域，该区域包含多个磷酸化位点，也是Cx43的主要功能域。αCT-1多肽通过靶向Cx43 C端，阻止Cx43与ZO-1相互作用，并通过竞争性抑制两种蛋白质上的PDZ结合域之间的相互作用，导致GJ通道斑块大小增加，有效调节伤口愈合。为进一步改进靶向疗法，降低脱靶效应，未来可以通过解析Cx43与不同蛋白因子或化合物形成的复合物结构，深入研究改善伤口愈合的详细分子和细胞机制；
或积极拓展目前靶向药物在其他皮肤疾病和组织损伤的临床前研究，如消化道、心脏和肺等；
或尝试CRISPR/Cas9等新兴技术体系在Cx突变相关疾病治疗中的运用研究。
无论在皮肤创伤愈合过程中Cx的差异表达，还是Cx突变与皮肤疾病的紧密相关性，都证明Cx家族成员在角质形成、细胞分化和维持皮肤屏障稳态过程中发挥着关键作用。然而，每种Cx因子在不同疾病模型中参与细胞间物质信息交换的确切调控机制，以及Cx突变致病机制仍有待深入研究。与所有遗传相关疾病一样，阐述清楚疾病的遗传因素是从机制上解决生物学问题并治愈疾病是基础。借助Cx突变体和转基因小鼠模型进行的体外功能研究，结合后基因组时代对患者细胞系建立详细的转录组表征，对个体患者基因分型，有望加快我们对Cx在正常皮肤组织功能和疾病发展相关机制中的理解。未来对于会引起疾病的Cx突变，可以设想对受影响细胞中的突变等位基因在发育早期或出生后不久被选择性消融或纠正，从而避免终生性器官损伤。
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