张东旭，冯 艳，张永芳，李 凤
(山西大同大学农学与生命科学学院，山西大同037009)
黑牛肝菌(Boletus aereus)，又称褐牛肝菌、铜色牛肝菌，属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌目(Agaricales)牛肝菌科(Boletaceae)牛肝菌属(Boletus)，其子实体通体呈黑色，味道鲜美，在我国四川、云南、贵州等多个地区广泛分布，在欧洲、非洲等地也有广泛分布，是一种世界性珍稀食用菌[1]。黑牛肝菌是目前1 000 多种牛肝菌之中唯一可以进行人工栽种和培养，已实现工厂化栽培的菌类[2]。黑牛杆菌具有“高蛋白、低脂肪、低热量”等的特点，是一种极具营养价值和商业价值的食用菌[3]。黑牛肝菌含有大量的风味物质[4-5]，这些物质不仅可以提供鲜美的味道,还具有丰富的生物活性，被广泛用在保健果饮、酱油、保健品、天然色素、调味酱、发酵酒、豆奶、复合调味料、米酒、牛肝菌豆瓣酱等生产之中。黑牛肝菌可以降低血清中的总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），提升高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量，对血脂有明显的降低作用[6]。黑牛肝菌提取物具有抵抗病毒、抵抗癌及提高人体免疫力的功效,可降低“三高”，在医药和食品保健领域有着极大的开发潜力和应用潜力[1]。黑牛肝菌多糖具有清除自由基[7]、保护急性酒精导致的内脏损伤[1]、抑制癌细胞的活性、调节内分泌，补血气等功效[8]。因此，规模化发展黑牛肝菌栽培产业前景光明。
在“林菌”产业发展中，恰当形式的菌种对提高栽培便利性、降低劳动力成本、降低材料成本以及降低生产复杂性具有重要意义。通过使用生物发酵技术[9]可以获得大量的菌丝体代替传统食用真菌栽培固体原种，充分利用了液体菌种生长速度快、菌丝活力高、生产成本低、使用便利等优点[10]。通过液体发酵技术制备菌种是黑牛肝菌人工栽植和及工厂化栽植的发展方向[11]。本研究旨在筛选出一种适宜黑牛肝菌液体发酵的培养基以及合适的培养条件，为推动黑牛肝菌“林菌”林下经济发展，助力晋北地区乃至全省的乡村振兴事业。
黑牛肝菌采购于甘肃临夏。
2.1 培养基的配制
菌种分离与活化使用PDA 培养基，菌种纯化使用CPDA 培养基，菌种活化使用M1 培养基[12]。
2.2 菌种的分离和纯化菌种分离
将新鲜的黑牛肝菌菌种接种至PDA 培养基上，在室温条件下培养3 周，待褐色菌丝长满培养皿后2～4 ℃冷藏备用。菌种纯化：用接种针挑去适量活化后的菌丝接种到CPDA纯化培养基上，在室温条件下，培养2 周。菌种活化：用接种针将纯化一代后的菌丝体适量接种至M1 培养基上，在室温条件下，培养2周即得发酵所用菌丝体。菌丝生成量的测定，用紫外分光光度计在波长600 nm 下测定菌液的吸光度值。
2.3 最适液体发酵培养基的筛选
参考前人研究，选择5 种液体发酵培养基进行黑牛肝菌液体发酵。培养基1 号：葡萄糖37.5 g/L、蛋白胨8.5 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁1 g/L、维生素B1 0.01 g/L、碳酸钙2 g/L[13]。培养基2 号：葡萄糖5 g/L、麦芽糖22.5 g/L、酵母膏14 g/L、硫酸铵2.7 g/L、磷酸二氢钾0.5 g/L、硫酸亚铁67 mg/L、硫酸铜100 μg/L。培养基3 号：葡萄糖30 g/L、玉米粉20 g/L、酵母膏7 g/L、磷酸二氢钾2 g/L、硫酸镁1 g/L、维生素B10.01 g/L、碳酸钙2 g/L[14]。培养基4 号：马铃薯100 g/L、麦麸30 g/L、蔗糖27 g/L、蛋白胨1.4 g/L、磷酸二氢钾0.85 g/L、硫酸镁1 g/L[15]。培养基5号：马铃薯200 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母膏5 g/L、牛肉膏3 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氢钾3 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁1.5 g/L、维生素B1 30 mg/L[16]。分别在250 mL 三角瓶中装入95 mL 的培养液，在121 ℃下高压灭菌20 min 后，接入半径4 cm 菌饼，培养温度28 ℃，摇床震荡转速160 r/min，培养8h，每2h 测定一次培养基的吸光度值，选取最适液体发酵培养液。
2.4 最适液体发酵条件的筛选
（1）最适转速的筛选：选取4号培养液，设定转速为120、140、160、180 r/min，经摇床培养8h，每2h测定一次培养基的吸光度，以确定最适转速。
（2）最适装液量筛选：选取4号培养液，在250 mL锥形瓶中分别装入50、65、80、95、110 mL培养液，经摇床培养8h，每2h测定一次培养基的吸光度，以确定最适装液量。
（3）最适培养温度筛选：选取4号培养液，分别在23、28、33、38 ℃下进行发酵培养，经摇床培养8h，每2h 测定一次培养基的吸光度，以确定最适培养温度。
3.1 最佳培养基的筛选
由图1-a 可知，初始接种牛肝菌菌液浓度较高的处理，在培养过程中菌液的浓度始终较高。就菌液的生长速率而言，显然4 号培养基的曲线斜率最大，培养效果最佳。因此，在后续培育条件研究中，均采用4 号培养基进行黑牛肝菌发酵培养。
3.2 最适转速的确定
由图1-b 可知，在恒温摇床的转速为160 r/min时，菌丝体生长速率最快，在培养8h就可以达到较高的浓度。不同摇床转速下菌丝体的吸光度值排序为：160 r/min＞180 r/min＞140 r/min＞120 r/min。因此，选择160 r/min 为牛肝菌液体发酵的最佳摇床转速，与郭永月等（2012）报道一致[13]。
3.3 最适装液量的确定
由图1-c可见，菌丝浓度的吸光度排序为：80 mL ＞95 mL ＞50 mL ＞110 mL＞65 mL。在250 mL的三角瓶中装液量为80 mL和95 mL时，牛肝菌生长菌丝体均在8h 达到理想浓度，但80 mL 装液量最佳。郭永月等（2012）的研究表明，在250 mL的三角瓶中装液量为95 mL 时，最适合牛肝菌发酵[13]。两个研究结果有一定差异。
3.4 最适培养温度的确定
由图1-d 可知，牛肝菌在23～38 ℃范围内，均可以快速生长，但是在培养温度为28 ℃时，菌丝生长最快。按菌丝体的吸光度排序为：28 ℃＞33 ℃＞38 ℃＞23 ℃。郭永月等报道牛肝菌液体发酵的最适温度是28 ℃[13]，罗顺珍等报道牛肝菌的最适发酵温度是27～33 ℃[17]，王文斌等报道暗褐网柄牛肝菌液体深层发酵的最适温度是29～33℃[18]。本研究结果与上述研究一致，28～33 ℃范是适合牛肝菌菌丝生长的温度，有利于缩短黑牛肝菌的生长周期，降低生产成本。
图1 黑牛肝菌在液体发酵培养条件下菌液的浓度变化规律
黑牛肝菌是一种非常值得研究和开发的药食同源食用菌，其含有大量的风味物质、茶氨酸和聚氨基-D-葡萄糖等，使黑牛肝菌的味道鲜美，有着很高食用价值。本研究发现4号培养基更适合牛肝菌发酵，该培养基原本是杏鲍菇发酵的培养基[16]。黑牛肝菌液体发酵的温度与摇床转速均与前人研究相似，但是最适装液量仅80 mL,与前人研究差异较大，可能与本研究的菌种有更高的生物活性有关。黑牛肝菌市场平均价格500 g 在60 元以上，且需求量逐年上升。黑牛肝菌液态发酵技术，为制备出干粉菌种，使低成本利用林下环境“仿野生”栽培牛肝菌成为可能，助力我省林下经济发展。
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