李 超，郝兴宇，李 萍，宗毓铮，张东升，史鑫蕊
（山西农业大学农学院，太谷 030801）
大豆是我国重要的粮油兼用作物，具有丰富的营养价值和广泛的用途。充足的氮素供应是保障大豆生产的关键因素之一。尿素作为主要的氮肥类型，在农业生产中占有很大的比重，但我国尿素氮的利用效率较低，仅为30%～40%。过量的尿素施用使土壤中的氮素残留量增加，增加了氮素向地下水淋失的风险，氨挥发、N2O等气体损失的增加也对大气环境造成了一定的危害［1］。
通过添加硝化抑制剂来调控土壤中的氮转化过程，是提高尿素氮的使用效率并减少环境污染的有效途径之一［2-3］。章淑艳等［4］的研究指出，氮肥基施配合硝化抑制剂可有效增加小豆的产量，并提高氮肥的利用效率。土壤铵态氮和硝态氮是作物吸收的主要氮素形态。在硝化抑制剂的作用下，土壤中的氮转化过程，特别是硝化作用发生变化，进而对土壤铵态氮和硝态氮的含量产生影响［2，5］。N2O是土壤硝化和反硝化过程的中间产物，其排放强度与土壤无机氮含量以及硝化反硝化酶活性密切相关。大量研究结果表明，添加硝化抑制剂可提高水稻等作物的产量和氮素利用效率，增加土壤中的硝态氮含量，降低铵态氮含量，N2O排放量也显著降低，但是不同的环境条件、硝化抑制剂类型等会使硝化抑制剂的作用效果产生一定的差异［6-7］。近年来，已有大量的学者对采用硝化抑制剂下不同作物生长及土壤氮转化过程进行了研究，但是大多数都仅关注了硝化抑制剂在当季作物生长过程中的影响，关于硝化抑制剂后效对下茬作物土壤氮转化影响的研究还相对较少。
气候条件是影响土壤-作物系统氮循环过程的主要因素。随着全球气候变暖的加剧，其已对全球范围内的农业生产产生了深刻的影响。国内外已有大量研究报道了关于大气CO2浓度或气温升高对氮循环的影响。研究指出，大气CO2浓度升高和适当的增温可以提高土壤酶活性，加速氮转化，增强土壤氮矿化、硝化和反硝化作用，从而使农田N2O的排放量增加［8］。在气候变化的背景下，如何在保证产量的同时提高氮利用效率，并降低温室气体的排放，是当前亟待解决的问题。在气温和大气CO2浓度升高的条件下，添加硝化抑制剂能否减轻N2O的排放尚不明确。对于小麦-大豆轮作模式，前茬小麦添加硝化抑制剂对于下茬大豆土壤中的N2O排放、无机氮含量和相关酶活性的影响有待深入研究。
本研究于山西省晋中市太谷区山西农业大学试验基地控制气室内进行，研究不同的环境条件（大气温度和CO2浓度）下，小麦季添加硝化抑制剂对大豆生长季土壤的硝态氮和铵态氮的含量、土壤硝化-反硝化相关酶活性以及N2O排放量的影响，探讨气候变化背景下添加硝化抑制剂的作用效果。该研究可为未来气候变化背景下大豆生产中温室气体减排及硝化抑制剂的合理利用提供数据支持。
1.1 试验地点和供试材料
试验地点位于山西省晋中市太谷区（37.42°N，112.58°E）山西农业大学试验基地控制气室内。该地区属温带大陆性气候，海拔767～900 m，年平均气温7～9℃，平均日照时数2 500～2 600 h。年平均积温在3 250～3 500℃之间，无霜期130～160 d，年平均地温13℃，年降水量450～500 mm。试验所用土壤类型为黏壤土，土壤有机质、全氮、速效氮、速效磷、速效钾含量分别为24.50 g/kg、1.40 g/kg、45.28 mg/kg、25.65 mg/kg、280.50 mg/kg，土壤pH值为8.2。供试大豆［Glycinemax(L.) Merr.］品种为中黄35，由中国农科院作物科学研究所培育。
1.2 试验设计
试验在4个独立的控制气室内进行。气室为铝合金框架玻璃结构（长×宽×高：8.0 m×3.0 m×3.2 m），采用自然光，玻璃透光率为80%～90%。4个气室分别为CK（环境CO2浓度+环境温度）、EC（CO2浓度升高200 μmol/mol+环境温度）、ET（气温升高2℃ +环境CO2浓度）与ECT（CO2浓度升高200 μmol/mol+气温升高2℃）。气室温度和CO2浓度由自动控制系统控制。
试验在控制气室条件下采取盆栽设计，在塑料整理箱（长×宽×高：60 cm×40 cm×30 cm）中进行，取农田耕层土壤过筛混匀，每箱装土30 kg，深约28 cm。盆栽试验为小麦-大豆轮作，小麦（TriticumaestivumL.）播种前施底肥（105.32 kg/hm2N、65.49 kg/hm2P和74.00 kg/hm2K），拔节期进行追肥，追肥与底肥的质量比为1∶1。小麦生长季在每个气室均设置了普通尿素与硝化抑制剂氮肥2个肥料处理，硝化抑制剂氮肥为普通尿素加0.1%吡啶混施。人工收获小麦后，用秸秆粉粹机将各气室小麦粉碎，分别均匀地还田到各气室盆中，大豆生长季不再施肥。2018年6月20日播种大豆，在每个整理箱中纵向开两排小沟播种大豆种子，出苗后每排留苗10株，10月2日收获大豆。每个处理设置4个重复，在气室中完全随机排列。期间视土壤含水量状况进行灌水，保证无干旱胁迫。
1.3 测定项目与方法
分别于大豆鼓粒期（2018年8月26日）、成熟期（2018年10月2日）用土钻从每个盆中随机取0～10 cm耕层的土壤，每盆3钻，手动除去肉眼可见的植物残渣、石块和其他杂质。将土壤样品充分混合，研磨过筛风干后保存在室温下，用于测定各个生育时期的酶活性和矿质氮含量。
土壤铵态氮含量采用氯化钾（KCl）浸提-靛酚蓝比色法测定，土壤硝态氮采用双波长紫外分光光度计法测定［9］。
土壤硝酸还原酶和土壤亚硝酸还原酶活性采用北京Solarbio公司的活性检测试剂盒进行测定，土壤氨单加氧酶和氧化亚氮还原酶采用上海抚生实业的酶联免疫试剂盒进行测定。
1.4 数据分析
使用Sigmaplot 12.5进行图表绘制，使用SPSS22单因素ANOVA对显著性进行分析，采用Turkey法对P值进行分析。
2.1 大气CO2浓度和气温升高下硝化抑制剂对大豆土壤铵态氮和硝态氮的影响
在大豆鼓粒期施用普通尿素时，EC、ET和ECT处理的土壤硝态氮含量分别比CK增加了30.85%、134.12%和48.28%，而在添加硝化抑制剂的条件下分别增加了28.96%、110.89%和81.92%。成熟期施用普通尿素和添加硝化抑制剂的条件下，EC、ET和ECT的土壤硝态氮含量分别较CK增加了111.39%、194.93%、87.52%和11.95%、43.39%、29.04%。整体上看，ET和ECT处理的硝态氮含量均显著高于CK，但EC与CK处理差异不显著。与施用尿素相比，添加硝化抑制剂对鼓粒期和成熟期的土壤的硝态氮含量影响较小，仅鼓粒期ECT处理、成熟期CK和ECT处理的硝态氮含量显著高于普通尿素（图1a、1b）。
升温条件下，土壤铵态氮的含量显著降低，鼓粒期施用普通尿素和硝化抑制剂分别比CK降低了46.66%和48.61%，成熟期分别降低了6.60%和25.07%。相较成熟期，鼓粒期的铵态氮降低幅度更大。EC和ECT处理的土壤铵态氮含量均有所增加，但与CK处理差异不显著。与施用普通尿素相比，在不同的环境条件下，添加硝化抑制剂鼓粒期土壤的铵态氮含量均略有增加，仅CK处理差异显著，其余条件下差异均不显著。成熟期添加硝化抑制剂对土壤铵态氮含量的影响均不明显（图1c、1d）。
图1 CO2浓度和气温升高对大豆土壤硝态氮和铵态氮含量的影响Fig.1 Effects of elevated CO2 concentration and increased temperature on soil nitrate and ammonium nitrogen content of soybean
由此可见，整体上气温升高使大豆土壤的铵态氮含量降低，硝态氮含量升高，且对鼓粒期的影响更为显著。大气CO2浓度增加（EC）或者同时升高气温和CO2浓度（ECT）对土壤铵态氮和硝态氮的影响较升温（ET）小，硝态氮和铵态氮的含量均有所增加，但是差异不显著。小麦季施用尿素中添加硝化抑制剂整体上使下茬作物大豆土壤中的铵态氮和硝态氮的含量均有所增加，但是增加的效果不明显。成熟期土壤的硝态氮和铵态氮的含量均低于鼓粒期。
2.2 大气CO2浓度和气温升高下硝化抑制剂对大豆土壤硝化反硝化酶活性的影响
氨单加氧酶是土壤硝化作用的主要限速酶，可以将铵根离子氧化为羟胺，硝化抑制剂也主要在此过程中发生作用。从图2可以看出，除成熟期ET处理外，添加硝化抑制剂后氨单加氧酶活性均降低。在鼓粒期，与CK相比，EC处理的氨单加氧酶活性变化不明显，而ET和ECT处理的氨单加氧酶活性显著降低，施用尿素和硝化抑制剂后氨单加氧酶活性分别降低了20.13%（ET）、22.26%（ET）和20.61%（ECT）、24.73%（ECT）（图2a）。成熟期的氨单加氧酶活性整体低于鼓粒期，且不同环境条件下添加硝化抑制剂对氨单加氧酶活性影响均不显著，ET和ECT处理的氨单加氧酶活性显著高于CK处理，施用尿素和硝化抑制剂后分别增加了43.03%（ET）、34.43%（ET）和22.78%（ECT）、24.37%（ECT）。成熟期EC和CK处理的氨单加氧酶活性差异不显著（图2b）。
硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和氧化亚氮还原酶均是反硝化过程的关键酶，其活性可以反应土壤反硝化能力的强弱。从图2c和2d来看，与CK相比，鼓粒期ET处理的硝酸还原酶活性显著提高，EC和ECT处理的硝酸还原酶活性与CK没有显著差异。成熟期不同环境条件下的硝酸还原酶活性没有鼓粒期差异大，CK、EC和ECT处理的硝酸还原酶活性较鼓粒期均有所提高，ET处理变化不明显。
图2 CO2浓度和气温升高对大豆土壤硝化反硝化酶活性的影响Fig.2 Effects of elevated CO2 concentration and increased temperature on soil nitrifying and denitrifying enzyme of soybean
鼓粒期不同环境条件下，亚硝酸还原酶活性差异不明显（图2e）。成熟期施用普通尿素时，EC和ET处理的亚硝酸还原酶活性较CK处理分别显著降低了26.35%和24.43%，ECT比CK降低了7.11%，但与CK差异不显著（图2f）。
鼓粒期未添加硝化抑制剂时，ET处理的氧化亚氮还原酶活性最高，但不同环境条件下的氧化亚氮还原酶活性差异均不显著；
添加硝化抑制剂时，ET处理显著高于CK和EC处理，ET与ECT处理差异不明显（图2g）。成熟期时，各处理氧化亚氮还原酶活性较鼓粒期均显著提升，ET和ECT条件下，添加硝化抑制剂时氧化亚氮还原酶活性较普通尿素处理显著降低；
ECT处理在未添加硝化抑制剂时的氧化亚氮还原酶活性最高，显著高于其余处理（图2h）。
2.3 大气CO2浓度和气温升高下硝化抑制剂对大豆土壤N2O排放的影响
在大豆整个生长季中N2O排放有2个峰值，分别为7月初和9月—10月（图3）。第一个排放峰值在7月5日左右，主要是ECT和ET 2个处理在施用普通尿素时有明显的排放峰值，明显高于其余处理。大部分的N2O排放发生在生育后期（9月4日—10月10日），该时期不同处理的N2O排放量占到整个生育期排放量的34.16%～90.68%，其中ET、ECT处理最高。该阶段在ET条件下施用普通尿素和硝化抑制剂时，N2O排放量占到整个生育期排放量的76.47%和90.68%，在ECT条件下的排放量分别占全生育期的59.97%（普通尿素）和75.63%（硝化抑制剂）。CK处理在添加硝化抑制剂时，生育后期的N2O排放量也比较高，占全生育期的68.98%。其余3个处理该阶段N2O排放所占比例相对较低，为34.16%～39.65%。
图3 不同处理大豆生长季土壤N2O排放通量Fig.3 Soil N2O emission flux during soybean growing season for different treatments
从大豆生长季N2O排放累积量来看（图4），ET和ECT处理的N2O累积排放量显著高于CK和EC处理，且都表现为添加硝化抑制剂相较普通尿素时N2O排放量更低。EC条件下，尿素和硝化抑制剂处理的N2O排放量均保持在较低水平。CK处理下，添加硝化抑制剂的N2O排放量明显高于普通尿素。
图4 大豆生长季N2O排放总量Fig.4 Total soil N2O emission during soybean growing season for different treatments
温度在土壤-作物系统氮素循环过程中起到关键的调控作用。升温条件下，土壤微生物活性增强，促进了土壤养分的循环与周转，增强了土壤的硝化作用、反硝化作用及氮矿化作用［10-11］。同时，土壤的酶活性提高，使更多的铵态氮转化为硝态氮［5］，并促进了土壤N2O的排放［12］。Chen等［13］研究发现，温度升高增加了0～5 cm土层的硝态氮含量，加快了氮矿化的速率，N2O排放量呈增加趋势。本研究中，气温升高条件下（ET），大豆土壤硝态氮含量均显著增加，而铵态氮含量降低，N2O排放量显著增加，这与Chen等［13］的研究结果基本一致。胡正华等［14］研究表明，N2O与土壤温度之间有着显著的正相关性。在增温条件下，大豆生长季的N2O排放通量显著增加了17.3%，排放总量显著增加了20.3%。而本研究中，升温条件下在未添加硝化抑制剂时，N2O排放总量较CK显著增加了173.6%，显著高于胡正华等［14］的研究结果。这可能与土壤本身的氮储量以及试验环境有关。从酶活性来看，本研究中升温条件下，仅成熟期的氨单加氧酶和鼓粒期的硝酸还原酶的活性显著增加，其余硝化反硝化酶活性变化不显著或有降低的趋势，这与前人的研究结果不太一致［5］，可能是因为观测期处于较为炎热的8到9月，温度过高反而抑制了酶活性。
大气CO2浓度升高可以促进植物的光合作用，使根系伸长，从而增强植物对土壤有效氮的吸收［15］，提高土壤微生物的数量和活性，增加土壤有机物的分解和氮矿化的速率［16］。同时，CO2浓度升高还可以提高土壤温度，通过提高土壤温度来影响土壤氮矿化速率［17］。张继舟等［18］开顶气室（opentop chamber，OTC）的研究结果表明，正常CO2浓度（370 µmol/mol）、中等 CO2浓度（550 µmol/mol）和高CO2浓度（700 µmol/mol）处理下，土壤全氮、硝态氮和铵态氮的含量均出现先升高后降低的现象，说明大气CO2浓度升高到一定范围内可以提高土壤的氮素含量，但超过一定的浓度会使得土壤氮素含量有所减少。本研究中，与CK相比，大气 CO2浓度升高（EC）条件下，土壤硝态氮和铵态氮含量均有所增加，这与张继舟等［18］正常和中等CO2浓度下的研究结果基本一致。如果继续升高CO2浓度可能造成土壤无机氮含量的下降，该结果需进一步验证。从酶活性来看，Baggse等［19］在开放式大气CO2浓度增加（free-air CO2enrichment，FACE）条件下的研究结果表明，欧洲四大草原的硝化反硝化酶活性的变化较小。Barnard等［20］分析了来自欧洲四个草地生态系统的试验结果，发现土壤的硝化和反硝化酶对高CO2无明显响应。本研究发现，四种硝化反硝化酶活性对CO2浓度升高的响应不明显，这与Baggse等［19］和Barnard等［20］的研究结果一致。大气CO2浓度升高的条件下，反硝化作用的增强导致了更多N2O的产生与排放。Lam等［21］用FACE系统研究发现，CO2浓度升高下冬小麦田间N2O的排放的增幅达到60%。本研究中EC条件下N2O排放量较CK无显著变化，这与前人的研究结果不太一致，可能是因为大豆整个生长期没有施肥，随着对土壤中氮素吸收量的增加，土壤中无机氮含量逐渐减少，土壤的硝化和反硝化能力降低。
通过向氮肥中添加硝化抑制剂可以有效调控土壤氮素的转化过程，延缓土壤铵态氮向硝态氮的转化，从而有效降低土壤中硝态氮的淋溶损失及N2O排放等。傅丽等［22］的研究结果表明，脲酶抑制剂与不同类型的硝化抑制剂组合均能不同程度地减缓尿素水解，增加土壤的有效氮含量。孙志梅等［2］研究表明，施用纯氮量1%的硝化抑制剂3，5-二甲基吡唑（3，5-dimethylpyrazole，DMP）可使土壤铵态氮含量提高30%以上，硝态氮含量降低20%左右。本研究中，与单纯施用普通尿素相比，在不同环境条件下，小麦季添加硝化抑制剂处理，大豆季土壤中的硝态氮和铵态氮的含量均有所增加。这与孙志梅等［2］的研究结果不一致，主要是因为本研究中大豆生长季并未添加任何氮肥和硝化抑制剂，土壤中的氮素除了根瘤固氮外，主要来自于小麦秸秆还田后的氮素矿化以及上一季的土壤残留氮。添加硝化抑制剂后，有效抑制了小麦季的氮素淋溶和气体损失，增加了土壤中的有效氮含量。从土壤酶活性来看，前人研究表明，硝化抑制剂主要通过影响氨单加氧酶的活性来控制铵态氮向硝态氮的转化［3，23］。本研究中硝化抑制剂处理鼓粒期氨单加氧酶活性较普通尿素均有所降低，但差异不显著，其余硝化反硝化酶活性也基本对硝化抑制剂的响应不明显。这主要是因为硝化抑制剂是在小麦季添加的，硝化抑制剂一般在使用后的40～90 d内起作用［24］，因此对后茬作物的影响较小。从N2O排放量来看，当前环境条件下（CK），小麦季添加硝化抑制剂显著提高了大豆生长季的N2O排放总量，较单施尿素处理提高了108.53%；
大气CO2升高条件下（EC），两者差异不明显；
升温（ET）以及同时升高温度和CO2浓度（ECT）时，硝化抑制剂处理的N2O排放总量较普通尿素分别降低了5.70%和29.08%。这与前人硝化抑制剂抑制N2O排放的研究结果不太一致，可能与硝化抑制剂施用的环境条件有关。硝化抑制剂的作用效果受土壤类型、质地、施肥种类、施肥方式及施氮量、硝化抑制剂施用量、土壤温度及土壤水分等综合因素的影响［23］，不同环境条件下硝化抑制剂作用效果有明显差异，进而对N2O的排放产生影响。
通过不同环境条件及硝化抑制剂处理对大豆土壤无机氮含量、硝化反硝化相关酶活性及N2O排放的影响的分析可得出如下结论：
1）小麦-大豆轮作，小麦季添加硝化抑制剂配合秸秆还田可使大豆季土壤硝态氮和铵态氮均有所增加，但是对大豆季土壤硝化-反硝化酶的活性影响较小。
2）升温使大豆土壤的硝态氮含量显著增加，而铵态氮含量显著降低；
大气CO2浓度增加或者同时升高气温和CO2浓度，土壤的硝态氮和铵态氮的含量均有所增加，但与CK差异不显著。
3）不同环境条件下的土壤硝化-反硝化酶的活性没有明显规律。
4）ET和ECT条件下，大豆生长季N2O排放总量均显著高于CK处理，且添加硝化抑制剂使N2O排放量降低，EC与CK条件下的N2O排放量差异较小，但在CK条件下硝化抑制剂处理的N2O排放量显著高于普通尿素处理。
本研究仅为一年的试验结果，气候变化背景下硝化抑制剂对大豆土壤无机氮含量及N2O排放的影响还有待进一步的试验验证。
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