杜洪波,巩杰,高婷,李传荣
一株高效促生菌株的分离筛选与发酵条件初探
杜洪波,巩杰,高婷,李传荣*
山东农业大学林学院, 山东 泰安 271018
为筛选能有效促进植物生长的促生细菌，从山东省泰安市泰山山脉常年生长植株根际土壤中分离获得一株芽孢杆菌TG-5。通过形态学特征和16S rRNA分析，将其鉴定为苏云金芽孢杆菌（）。采用NBRIP培养基对溶磷能力进行测定，结果表明：苏云金芽孢杆菌TG-5对磷酸钙培养基溶磷效果较好，与对照相比，该菌株溶磷效率是其他菌株3倍以上，最高达10.7倍以上。通过对该菌株固体发酵条件初探，发现发酵培养基主要成分玉米粉和大豆粉的最佳配比为2:3、碳氮源分别为玉米粉和大豆粉时生物量最大。上述试验证明苏云金芽孢杆菌TG-5具有较好的促生应用潜力，可进一步扩大培养。
土壤微生物; 苏云金芽孢杆菌; 分离; 发酵条件
微生物群落的多样性、相对丰度和活性在土壤有机质分解、养分循环、系统稳定性和抗干扰能力中起着核心作用[1-5]。鉴定植物相关细菌、分析它们与宿主的相互作用以及了解这些相互作用促进两种生物生存的方式对于制定保护这些植物的策略至关重要[6]。
土壤微生物是陆地生态系统中植物多样性和生产力的重要驱动因素[7]。粗略估计，大约25%的植物依赖于营养不良的天然土壤中的固氮细菌[8]。PGPR还可以改变根系结构、形态、导水率和激素状态，并可以释放与压力积累渗透相关的各种挥发性化合物（如谷氨酸、脯氨酸和肽），杀死病原体[9,10]。根际土壤是农田生态系统中动态而复杂的元素[11]。共生菌存在于所有植物中，这种关系可能是植物抗逆性的关键因素。事实上，植物对环境的局部适应是由密切相关的PGPR之间的遗传分化驱动的[12]。在没有细菌的情况下移植各种植物物种是出了名的困难[13]，这种困难支持了细菌对植物生长的重要性，包括在压力条件下[14]。
1.1 材料
1.1.1 菌株的分离本文用于分离菌株的土壤采集自中国山东省泰安市泰山山脉的作物根际土壤。无菌条件下取作物根际土5 g，溶于45 mL无菌蒸馏水中，220 r/min，振荡培养30 min。吸取1 mL土壤悬浮液与9 mL的无菌水混匀，即得10-1稀释液，再取1 mL·10-1的稀释液与9 mL的无菌水混匀，即得10-2稀释液，依稀类推，制备10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等一系列稀释液。用移液器吸取100 μL的土壤稀释液于各分离培养基平板中央，涂布器涂抹均匀，37 °C恒温培养1～3 d。细菌分离采用LB固体培养基，选用的稀释度为10-4、10-5和10-6；
真菌分离采用马丁氏培养基，选用的稀释度为10-3、10-4和10-5；
放线菌分离采用高氏一号培养基，选用的稀释度为10-4、10-5和10-6。
1.1.2 培养基无机磷筛选培养基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母提取物0.5，磷酸钙5.0，硫酸铵0.5，氯化钾0.2，硫酸镁0.1，硫酸锰0.000 1，硫酸亚铁0.000 1；
IAA培养基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，色氨酸1.0。
1.1.3 主要试剂和仪器酵母提取物、牛肉浸膏、氯霉素、磺胺、氟苯尼考，麦克林公司；
庆大霉素、氯霉素、IAA标准品、1-氨基环丙烷羧酸标准品，Sigma公司。
DNA提取试剂盒，北京擎科生物工程有限公司。
梯度PCR仪，Thermo Fisher Scientific公司。
高速冷冻离心机，Sigma公司。
火焰原子吸收光谱仪，耶拿公司。
紫外分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司。
1.2 高效促生菌株的筛选
采用苯胺蓝、羧甲基纤维素钠、愈创木酚、固氮、溶磷、解钾实验作为筛选条件，只有同时满足三种及以上的作为高效促生菌株备选。
1.3 生理生化及形态鉴定
将筛选出促生菌株接种于LB固体培养基上，37 ℃培养48 h后观察菌落并进行显微镜检，然后按照《伯杰氏系统细菌学手册》[15]进行生理生化鉴定。
1.4 菌株生理生化鉴定
在营养琼脂固体平板37 ℃恒温培养30 h，记录菌落的大小、颜色、形状、透明度、湿润程度以及表面边缘隆起程度等。根据《伯杰细菌鉴定手册》[15]和《微生物学实验教程》[16]，对菌株进行革兰氏染色和芽孢染色，吲哚乙酸产生，甲基红、VP、明胶酶、淀粉酶、苯丙氨酸脱氢酶、氧化氢酶、尿素酶、蛋白水解酶、β-半乳糖苷酶等常规生理生化的特征鉴定。
采用艾科瑞公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行菌株基因组DNA的提取。以提取的DNA作为模板，以细菌的通用引物27F/1492R对菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增。将PCR产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI blast进行对比，通过软件MEGA-X进行序列相似性分析，并构建系统发育树。
1.5 菌株生长条件优化
1.5.1 发酵培养基中最佳C、N、无机盐的筛选以标准配方的LB液体培养基作为对照，将LB液体培养基中的酵母提取物（碳源）分别换成等量（5.0 g·L-1）的可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和玉米粉，其他物质不变，制备不同碳源的发酵培养液，每250 mL三角瓶装100 mL，按照2%种子液接种量，将供试菌株接种于不同碳源的发酵培养液中，30 ℃，180 r·min-1摇床上振荡24 h，测定发酵反应液的OD 600值，每个碳源培养液重复3次，筛选出最佳C源。利用同等重量（10 g·L-1）尿素、黄豆粉、(NH4)2SO4、牛肉膏、豆饼代替LB培养基中的氮源（胰蛋白胨），发酵反应条件同C源的筛选，筛选出最佳氮源[17]。
利用重量（10.0 g·L-1）ZnSO4、FeSO4·7H2O、K2HPO4、MgCl2、Ca(NO3)2代替LB培养基中的无机盐（NaCl），发酵反应条件同C源的筛选，筛选出最佳无机盐。
1.5.2 培养条件的筛选与优化以1.5.1优化后的培养液为液体发酵最佳培养基，依次对培养基中pH 值、接种量、培养温度、转速及培养时间进行筛选与优化，每个处理3次重复。设置pH值为：6.0、7.0、和8.0，250 mL三角瓶中装100 mL发酵培养基，种子液按接种量1%、2%、5%，180 r·min-1，30 ℃，振荡培养24 h，根据发酵反应液OD600值，确定最佳pH值；
在确定发酵反应最佳pH值后，将发酵反应温度设置为：30 ℃、37 ℃、39 ℃，250 mL三角瓶中装100 mL发酵培养基，种子液按接种量1%，180 r·min-1振荡培养24 h，根据OD600值，筛选最佳反应温度；
在确定最佳pH值和反应温度下，在确定最佳pH值、温度和装液量后，接种量设置为下列梯度：1%、2%、5%，30 ℃，180 r·min-1，培养24 h，根据不同处理OD600值，筛选最佳接种量；
在确定最佳pH值、温度、装液量和接种量后，转速设置为：180 r·min-1、200 r·min-1、220 r·min-1，培养24 h，根据不同处理OD600值，筛选最佳转速。
1.5.3 液体发酵培养基组分的优化
表 1 培养基组分的正交实验因素与水平
1.6 菌株发酵过程中溶解无机磷能力测定
将待检测菌株活化后，以1%比例接种于以磷酸钙作为唯一磷源的液体无机磷筛选培养基，37 ℃、180 r/min振荡培养5 d后开始取样，4000 r/min离心10 min，取上清液检测可溶性磷浓度。实验中的对照为苏云金芽孢杆菌，购自乳山韩威生物科技有限公司，上清液中的磷浓度采用钼锑抗比色法[18-22]检测。
1.7 双抗生素菌株的筛选
刮取2环PGPR菌株新鲜培养物，接种到不含利福平的LB液体培养基中，30 ℃，200 r/min培养24 h，作为种子液。将种子液以2%（体积比）的接种量接种到含5 µg/mL利福平(Rifampicin)的LB液体培养基中，摇瓶培养24 h；
将该培养液以2%的接种量接种到含10 µg/mL利福平的LB液体培养基中，摇床培养24 h；
依次类推，使利福平的浓度逐渐由5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、150 µg/mL直至增加到300 µg/mL，培养得到抗利福平的菌株。将得到的抗利福平菌株接种到含300 µg/mL利福平和5 µg/mL氯霉素（Chloramphenicol）的LB液体培养基中，对同时抗利福平和氯霉素的双抗菌株进行筛选，筛选过程中，LB液体培养基中利福平的浓度为300 µg/mL，氯霉素浓度的递加及筛选方法与抗利福平菌株的筛选方法相同，最终获得同时抗利福平和氯霉素的双抗标记菌株。
1.8 数据统计
采用EXCEL2003和SPSS23.0软件对数据进行统计分析。采用单因素（one-way ANOVA）和Duncan法进行方差分析和多重比较（=0.05），方差不齐的则采用非参数Kruskal-Wallis法进行差异显著性检验（=0.05）。表中数据为平均值±标准误差。
2.1 菌种的分离与筛选
从LB固体培养基和PDA固体培养基共分离处92株菌。通过苯胺蓝、羧甲基纤维素钠、愈创木酚、固氮、溶磷、解钾实验作为筛选条件，同时满足三种及三种以上条件者为目标菌株，获得TG-5菌株[23]。
2.2 目标菌株鉴定
形态学鉴定显示：TG-5该菌革兰氏染色阳性，在LB培养基上37 ℃培养24 h后，单菌呈乳白色、不透明、不规则、隆起、边缘波状。显微镜观察发现，菌落为圆形或者椭圆形，淡黄色，边缘不规则，不透明微隆起呈滴蜡状。苏云金杆菌菌体在显微镜下呈紫色椭圆形杆状，大小为（1.2～1.8）μm×（3.0～5.0）μm，呈短链或者长链状排列，芽孢为椭圆形，靠近中间生长，芽孢囊微膨大。
2.3 生理生化特征
表 2 TG-5生理生化鉴定结果
2.4 菌株的分子生物学鉴定
TG-5的16S rRNA基因序列以登录号RID-8MG9P79F013 QUERY-39355保存在NCBI数据库中，初步鉴定该菌为苏云金芽孢杆菌[24,25]。
图 1 TG-5的16S rRNA基因序列
2.5 菌株生长特性
2.5.1 发酵培养基中最佳C、N、无机盐[26,27]
图 2 不同碳源吸光度变化
图 3 不同氮源吸光度变化
图 4 不同无机盐吸光度变化
图 5 不同培养时间吸光度变化
2.5.2 培养条件的筛选与优化
图 6 不同接种量对吸光度的影响
图 7 不同温度对吸光度的影响
图 8 不同pH值对吸光度的影响
图 9 不同转速对吸光度的影响
2.5.3 正交实验培养基组分的优化
表 2 培养基各组分比优化的正交试验结果
其中，1值：每个因素下对应水平为1的实验结果的和；
2就是每个因素下对应水平为2的实验结果的和；
是每个因素下的最大值减最小值。
2.6 菌株发酵过程中溶解无机磷能力测定
图 10 不同菌株解磷吸光度变化
其中，T0为目标菌株TG-5；
T1为苏云金杆菌；
T2为地衣芽孢杆菌；
T3为解淀粉芽孢杆菌；
T4为枯草芽孢杆菌
2.7 双抗生素菌株的筛选
将筛选的双抗标记菌株在不含利福平和氯霉素的LB固体培养基和LB液体培养基中，交替培养3～5代，再分别回接到含利福平300 µg/mL和氯霉素300 µg/mL的LB液体培养基中培养，以证实菌株耐药稳定性，最终获得能够稳定遗传并且同时抗利福平和氯霉素的双抗标记菌株用于以后实验。
苏云金芽孢杆菌在杀虫促生功能与代谢产物上都不尽相同，因此，准确的分类鉴定对其在农林生产中的应用具有重要意义[28]。在研究苏云菌株促生潜力之前必先清楚不同碳源对菌株生物量的影响以免造成混淆以及在制剂生产过程中不必要的烦扰。通过形态学来确定苏云菌的分类地位向来是研究者的一个难题，因为同一属的不同菌种，特别是相近种在形态学上的差别不大。单从形态特征等方面去确定苏云菌的种间分类地位，其鉴定结果的准确性很难令人信服。因此，本研究在形态学比对的基础上，采用16sRNA基因序列分析作为辅助鉴定手段，提高了菌株TG-5鉴定的准确性。国内外大量的研究结果表明，苏云菌的杀虫作用具有广谱性，集定殖能力强和多种拮抗机制并存等优势。筛选出的培养基中添加玉米粉与黄豆粉时，生物量最大。筛选出的培养基中分别添加氯化钙、硫酸亚铁、磷酸铝3种无机氮源时，三者对生物量的影响不显著，因此选用氯化钙[29-32]。上述试验说明苏云金芽孢杆菌TG-5所使用发酵材料较为廉价易得，可进行大量扩繁，投入生产，具有制成促生制剂的潜力。苏云金芽孢杆菌TG-5是从山东省泰安市干旱瘠薄山地根际土壤中分离得到的一株具有良好促生作用的菌株，其对钾长石粉和枸溶性磷有良好的活化作用，对作物形态学指标具有较明显的促生作用，所使用的固体发酵材料廉价易得。综上，该菌株具有较好的促生应用潜力。但田间情况复杂，苏云菌群体的定殖能力和生存能力受到一定的限制，其促生效果不稳定。因此，有关该菌株对作物植物促生的作用机理以及在田间的定殖能力和生防效果还有待于进一步试验和研究。
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Isolation and Screening of a High-efficiency Growth-promoting Strain and Preliminary Exploration for Fermentation Conditions
DU Hong-bo, GONG Jie, GAO Ting, LI Chuan-rong*
271018,
In order to screen the growth-promoting bacteria that can effectively promote plant growth, aTG-5 was isolated from the rhizosphere soil of perennial plants in Taishan Mountains, Tai"an City, Shandong Province. It was identified asby morphological features and 16SrRNA analysis. The phosphorus-dissolving ability of NBRIP medium was measured. The results showed thatTG-5 had better phosphorus-dissolving effect on calcium phosphate medium. 10.7 times or more. Through preliminary exploration of the solid fermentation conditions of this strain, it was found that the optimum ratio of the main components of the fermentation medium, corn meal and soybean meal, was 2:3, and the biomass was the largest when the carbon and nitrogen sources were corn meal and soybean meal, respectively. The above experiments proved thatTG-5 has good growth-promoting application potential and can be further expanded.
Soil microbe;; isolation;fermentation condition
S154.34
A
1000-2324(2022)06-0825-07
2022-03-20
2022-04-12
山东省林业科技创新项目(2019LY005)
杜洪波(1982-),男,博士研究生,专业方向恢复生态学. E-mail:843029963@qq.com
Author for correspondence. E-mail:chrli@sdau.edu.cn
10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.002
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