林佩贤 黄宝添 辜红妮 黄靖宇 许斐斐 林伟青
1 汕头大学医学院第二附属医院医院感染管理科，汕头 515041；
2 汕头大学医学院附属肿瘤医院放疗科，汕头 515041
鲍曼不动杆菌（也称鲍氏不动杆菌）是一种非发酵的革兰阴性菌，其中耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）是引起医院感染的重要病原菌[1]。根据中国抗菌药物监测网的报告，约80%的鲍曼不动杆菌对亚胺培南或美罗培南耐药[2-3]，给临床抗感染治疗带来较大困难。WHO 公布的新型抗菌药物研发重点病原体清单中，CRAB 被列为最受关注的革兰阴性菌[4]。ICU 是医院感染多发的科室，ICU 病区鲍曼不动杆菌和CRAB 所致的医院感染分别占20.9%和13.6%[5]，也曾有CRAB 引起医院感染流行和暴发的报道[6-7]。本研究对汕头某医院ICU 病区患者CRAB的感染特点和同源性进行分析，现将结果报告如下。
一、研究对象
以2020年7月至2021年6月汕头大学医学院第二附属医院ICU 病区收治的检出鲍曼不动杆菌患者为研究对象，按检出菌是否为CRAB 分为病例组和对照组。医院感染病例诊断标准按原卫生部2001年《医院感染诊断标准(试行)》执行。纳入排除标准：纳入检出鲍曼不动杆菌的病例，排除住院时间少于48 h 的病例，同次住院期间检出耐药菌的病例不纳入对照组。本研究经汕头大学医学院第二附属医院伦理委员会审查通过[审批号：汕大医附二伦审科（2022-104）号]。
二、菌株鉴定和药敏试验
检测患者入院后的痰液或分泌物，收集检出的第1 株鲍曼不动杆菌菌株。按照《全国临床检验操作规程》第3 版要求分离培养病原菌，参照2019年美国临床和实验室标准化协会（CLSI）推荐的药敏试验要求[8]，采用法国梅里埃公司的VITEKcompact2 微生物自动分析仪和配套药敏卡进行药敏试验。以大肠埃希菌标准菌株ATCC25922、铜绿假单胞菌标准菌株ATCC27853 进行药敏质控检测。
三、PFGE 试验
挑取鲍曼不动杆菌单菌落接种营养平板，37 ℃孵育过夜。制备胶块，使用60 U ApaⅠ（TAKARA 公司）内切酶进行酶切，在37 ℃孵育4 h。在CHEF-DRⅢ（Bio-Rad Laboratories 公司）电泳仪中进行脉冲场电泳，使用GelRed 核酸染料染色，在读胶仪中成像。PFGE 图像录入BioNumerics 软件包进行处理，经校正后根据每两个图像之间的相似性系数，用非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类，构建聚类树。PFGE 分型标准：
图谱条带数量和大小相同为同一型别，3 个条带以下有差异为同一型别的不同亚型，4 个条带以上差异为不同型别。
四、耐药基因检测
参照QUIGEN 试剂盒提取细菌基因组DNA 制备DNA 模板。PCR 扩增：（1）VIM、IMP、SIM、NDM-1、ADC 各靶基因 PCR 扩增体系为20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，10 μmol/L 上下游引物各1 μL，模版1 μL；
扩增参数为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性50 s，其中退火温度VIM、IMP 和ADC 为55 ℃，NDM-1 和SIM 为58 ℃，退火时间均为30 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环，72 ℃最后延伸6 min。取PCR 反应产物4 μL，以1%琼脂糖凝胶电泳，120 V电泳25 min 后凝胶成像系统成像。阳性PCR 产物送测序公司进行测序。（2）OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58 和OXA-143：多重PCR 法，反应体系为20μL：2×Taq Master Mix10 μL，ddH2O 4 μL，正反向引物各0.5 μL（10 μmol/L），模板1 μL。扩增参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共30 个循环，72 ℃最后延伸6 min。取PCR 反应产物4 μL，以1%琼脂糖凝胶电泳，120 V电泳25 min 后凝胶成像系统成像。阳性PCR 产物送测序公司进行测序，将测序结果开展blast 比对进行确认。目的基因和引物序列详见表1。
表1 目的基因和引物序列
五、统计学分析
以Epidata3.1 双录入并核对数据，应用SPSS19.0 进行统计分析。正态性检验方法采用P-P图和Shapiro-Wilk 检验，服从正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立两样本均数t 检验。计数资料采用例数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
一、感染患者一般情况
感染鲍曼不动杆菌患者共41 例，按检出菌是否为CRAB 分为病例组（17 例）和对照组（24 例），其中病例组男性12 例，女性5 例，年龄为(52.06±21.28)岁；
对照组男性22 例，女性2 例，年龄(49.17±20.44)岁，两组性别、年龄分布差异无统计学意义( χ2=3.12，P=0.077；
t=0.44，P=0.663)。结合临床表现，病例组和对照组分别有13 例和15 例判断为感染菌，均为肺部感染，余考虑为定植菌。
二、抗菌药物使用、院感发生情况和转归比较
病例组使用碳青霉烯类抗菌药物、抗菌药物使用天数≥10 d、检出菌为医院感染病原菌的比例分别为9/17、14/17 和12/17，均高于对照组，差异均有统计学意义（ χ2=6.05、9.62 和5.53，P 均＜0.05）。具体结果见表2。
表2 汕头大学医学院第二附属医院ICU 病区患者的抗菌药物使用、机械通气、院感发生情况和转归比较
三、CRAB 菌株耐药性及同源性分析
1、药物敏感试验结果
由表3可见，检出的CRAB 除对替加环素敏感外，对其他抗菌药物均呈不同程度耐药。对亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、头孢曲松、头孢吡肟和复方磺胺甲 唑的耐药/中介率均在80%以上，头孢哌酮/舒巴坦耐药率为11/17，氨基糖苷类中妥布霉素的敏感率稍高，为6/17。
表3 汕头大学医学院第二附属医院ICU 病区耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的药敏结果（n=17，株）
2、同源性及耐药基因分析
经PFGE 电泳图谱聚类分析，17 株CRAB 分为9 个型别，见图1。其中5 个型别只包含1 株菌株，其余4 个型别分别包含2～4 株菌株，提示可能存在流行病学关联。17 株菌中有16 株检出ADC 基因，1株检出SIM 基因，8 株检出OXA-51-like 基因。4 株CRAB 菌株检测出多个耐药基因。
图1 汕头大学医学院第二附属医院ICU 病区耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的PFGE 聚类分析图
随着亚胺培南在临床上的广泛应用，对碳青霉烯类抗菌药物耐药的临床分离菌株越来越多[9]。为应对此类广泛耐药细菌所致感染，检验科需要积极与临床医生沟通，开展多黏菌素、替加环素和头孢他啶-阿维巴坦的药敏试验[10]。本文分析汕头某医院ICU 病区CRAB 的感染特点和同源性，可更好地指导临床用药并有效控制相关医院感染。
一、CRAB 菌株耐药率较高
本次研究结果显示，CRAB 感染患者与一般鲍曼不动杆菌患者的性别、年龄无差异，但感染前使用碳青霉烯类抗菌药物和长时间抗菌治疗者检出CRAB 的概率增加，长时间使用抗菌药物促使耐药菌的产生，应持续加强碳青霉烯类抗菌药物合理用药管理[11]。药敏结果显示，CRAB 菌株对除了替加环素外的抗菌药物耐药率均高，基于碳青霉烯类耐药菌株的广泛耐药特征，常规药敏试验结果往往显示仅对替加环素、多黏菌素和头孢他啶-阿维巴坦敏感。同时，报道显示此类患者的住院费用和住院日数也增加[12]。CRAB 菌株多为医院感染致病菌，因此控制CRAB 菌株在医院环境的流行传播是医院感染防控工作的重要内容。
二、CRAB 存在ICU 环境内传播
ICU 内患者和环境中存在鲍曼不动杆菌的克隆传播，造成环境污染以及患者交叉感染[13]。本研究发现大部分CRAB 为医院感染菌，部分PFGE 型别存在多个克隆菌株。现场调查发现ICU 收治的时间有重叠，由同组医护人员诊疗护理，工勤人员进行床单元清洁消毒存在顺序错误、同一清洁巾擦拭范围过大等不规范的情况。结合病例的住院时间、诊疗护理和清洁消毒情况分析，表明虽然散发菌株可能为外部输入，但院内传播仍是CRAB 流行传播的主要形式。ADC 基因是CRAB 固有耐药基因[14]，本次检测在17 株CRAB 菌株中有16 株检出ADC 基因，与既往研究结果基本相符[15]。约1/4 的菌株包含2种以上耐药基因，说明其耐药机制具有多样性和复杂性。
三、应采取综合干预措施加强CRAB 防控
主动监测、强化接触隔离和限制抗菌药物使用可减少CRAB 的感染和定植[16]。CRAB 医院感染流行或暴发与环境及物体表面清洁消毒不到位有关，曾有报告ICU 的器械开关检出的鲍曼不动杆菌与患者检出菌株完全同源[17]。医护人员流动性大、岗前培训不足导致床单位终末消毒不彻底可能是CRAB传播的重要原因[18]。
综上所述，CRAB 感染的防控需要采取加强手卫生、个人防护、培训督导、落实日常消毒和终末消毒、规范抗菌药物使用等一系列综合干预措施。但本研究未同步对病房环境进行微生物学采样和同源性分析，以进一步验证CRAB 在病房环境中的传播情况，有待以后的研究中进行深入探讨。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
作者贡献声明林佩贤：研究设计和实施、文章撰写、统计分析、获取经费；
黄宝添：研究实施、统计分析、文章审阅；
辜红妮、黄靖宇：实验操作、采集数据；
许斐斐：采集及核校数据；
林伟青：研究设计指导、论文审阅
