周青宏，覃宗帅，郑频，王语阳，岑兰英，苏拾香，黄秀权，覃月秋
(1. 右江民族医学院附属医院消化内科，广西 百色 533000；
2. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000)
急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)具有急性起病和疾病过程多变的临床特点，多数AP患者病情较轻，仅有胰腺实质的局灶性炎症，病程自限，恢复快，预后好；
20%的AP患者进展为重症急性胰腺炎(SAP)[1]。在炎症过程中，由坏死或非致死性损伤细胞释放到细胞质中的血清高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)充当促炎细胞因子不断浸润细胞，导致炎性细胞释放各种介质，如一氧化氮(nitric oxide，NO)。大量AP的临床试验和动物模型结果表明[2-3]，包括HMGB1、NO在内的局部和全身炎症介质之间存在复杂的相互作用。HMGB1是一种在真核生物中普遍存在的、多功能的、与DNA结合的非组蛋白，广泛分布于多种哺乳动物细胞。在大多数细胞中，HMGB1位于细胞核，其参与调控转录、复制、DNA修复和核小体形成等过程，这些过程对于维持体内稳态细胞功能具有重要作用[4]。
HMGB1一旦由细胞核进入细胞质，就会产生多种炎症反应，并可以主动释放到细胞外空间和循环中。HMGB1已经被证实在AP中高表达，与胰腺腺泡细胞损伤及病情发展密切相关[5]。NO是一种气态的神经递质，是具有高度活性的自由基，由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitic oxide synthase，NOS)同工酶催化作用下产生[6]。NO是血管扩张剂和旁分泌调节剂，它具有复杂的生物作用，可作为抗炎介质参与炎症过程，浓度过高时可产生细胞毒作用，对机体造成损害。在胰腺中，NO可调节胰腺外分泌、内分泌胰岛素的分泌和胰腺微血管血流[7]。AP中的NO明显升高，其促进炎症因子的产生，加重炎症反应，并增加了疼痛因子的表达。研究发现，HMGB1促使胰腺腺泡细胞NO生成增多，而NO致腺泡细胞损伤，HMGB1和NO的关系有待进一步阐明[2]。本文采用ELISA、分光光度法检测HMGB1及NO水平，探讨HMGB1、NO对评估AP严重程度、患病的敏感性和特异性，分析不同严重程度AP中HMGB1与NO表达的相关性。
1.1 一般资料 收集2021年9月至2022年9月于右江民族医学院附属医院治疗的70例AP患者资料，其中轻症急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)组27例，中度重症急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)组21例，重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)组22例，同时选取本院同期健康体检者32例作为对照组，4组的一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。AP诊断及分级标准符合《中国急性胰腺炎诊治指南(2021)》[8]。入选病例均排除心脑血管疾病、肝肾疾病、自身免疫性疾病、血液系统疾病及肿瘤等。本研究经医院医学伦理委员会批准，受试者签署知情同意书。
表1 4组一般资料比较结果
1.2 方法
1.2.1 收集样本 收集患者的一般资料(年龄、性别)。采集入院24 h内空腹静脉血3～5 mL，室温静置2 h，3000 r/min，离心15 min，抽取血清放入Eppendor管中，置于-80 ℃冰箱冷冻保存待检，做好预处理后分别测定血清中的HMGB1及NO水平。
1.2.2 HMGB1检测 按照Human HMGB-1 ELI-SA Kit(Elabscience Biotechnology，中国，武汉)试剂盒说明书做好前期工作准备并按步骤操作，用酶标仪测定在450 nm波长处血清的OD值，HMGB1浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出血清中HMGB1的浓度，见表2。
1.2.3 NO的检测 按照NO检测试剂盒(Beyotime Biotechnology，中国，上海)说明书步骤操作，用分光光度法测定血清在560 nm的吸光度，通过绘制标准曲线计算出样品中NO的浓度，见表2。
表2 4组患者HMGB1、NO对比结果
2.1 各组HMGB1、NO水平比较结果 MAP组、MSAP组、SAP组患者血清中HMGB1、NO水平均高于对照组(P<0.01)；
MSAP组的NO水平高于MAP组(P<0.001)，而HMGB1水平差异无统计学意义(P>0.05)；
SAP组的HMGB1、NO水平高于MAP及MSAP组(P<0.05)，见图1。
注：A代表各组HMGB1水平差异；
B代表各组NO水平差异。*P<0.05；
**P<0.01；
***P<0.001；
△P为差异无统计学意义。图1 各组之间HMGB1、NO水平差异比较结果
2.2 HMGB1和NO评估AP严重程度及患病的ROC曲线 根据ROC曲线显示，HMGB1和NO对评估AP患病相较于评估AP严重程度的曲线下面积、敏感性和特异性更佳，见表3、表4、图2A、图2B。
表3 HMGB1和NO评估AP患病的ROC曲线数据分析结果
表4 HMGB1和NO评估AP严重程度的ROC曲线数据分析结果
注：A代表HMGB1和NO评估AP患病的ROC曲线；
B代表HMGB1和NO对评估AP严重程度的ROC曲线。图2 HMGB1、NO水平在不同程度AP中的ROC曲线分析结果
2.3 不同组别的HMGB1和NO的相关性分析结果 Spearman相关性分析显示，在MAP组、MSAP组中，血清 HMGB1 水平与NO水平无相关性(P>0.05)，见表5及图3A、图3B；
在SAP组中血清 HMGB1水平与NO水平具有相关性(r=0.672，P<0.001)，且呈正相关，见表5及图3C。
表5 不同组别的HMGB1和NO表达的相关性分析数据
图3 MAP组、MSAP组、SAP组中血清HMGB1与NO的相关性分析结果
HMGB1是一种染色体蛋白质，组织分布广泛，但多数位于细胞核。HMGB1的生理功能与其复杂的结构有关，它本身有助于DNA的合成以及染色质结构的稳定，作为炎症因子或损伤分子模式时，可以参与多条信号传导，促进细胞凋亡或炎性损伤[5]。NO是一种气态分子，其生成受到一氧化氮合酶(NOS)的催化以及精准电子链的传输控制，不同浓度的NO可以在人体产生不同的生理作用，NO水平升高往往提示炎症的进展。目前，关于AP中HMGB1与NO的关系尚未有明确的定论。HMGB1通过参与多种信号通路，诱导炎症因子的产生，导致胰腺损伤，而NO是AP局部和全身炎症的潜在关键介质，特定NOS抑制剂的实验研究支持NO是在NOS介导下产生并发挥作用[9-10]。HMGB1可以与下游受体结合，触发NF-κB核移位并活化[1]，诱导巨噬细胞中iNOS表达增加，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性增加，促使大量NO产生，当NO浓度达到一定程度时，会对胰腺产生不可估量的损害，使得AP患者病情迅速恶化[11]。尽管HMGB1和NO已经被证实在AP中高表达，但其临床意义及HMGB1和NO相互作用与AP炎症损伤之间的关系少见报道。
为了探讨在AP中HMGB1与NO之间是否存在相互关系，本研究收集了不同严重程度的AP患者的血清，采用ELISA、分光光度法检测血清中的HMGB1及NO水平，探讨在不同严重程度的AP中HMGB1和NO表达水平的差异对AP患病及评估AP严重程度的敏感性和特异性，分析HMGB1与NO表达的相关性，阐述它们之间可能存在的相互关系。各组HMGB1和NO表达水平结果显示，MAP组、MSAP组、SAP组患者血清中HMGB1、NO水平均显著高于对照组，AP严重程度越高，HMGB1及NO的水平越高，两者表现出相同的趋势，与前人研究的结果一致[3，9]。
本课题组进一步进行ROC曲线分析，结果提示HMGB1及NO对AP患病及病情严重程度的评估有一定的价值。对于AP患病的评估，HMGB1的AUC为0.825，P<0.001，其敏感性及特异性分别为78.60%、87.50%，NO的AUC为0.931，P<0.001，其敏感性及特异性分别为81.40%、93.90%；
对于AP严重程度评估，HMGB1的AUC为0.705，P<0.01，其敏感性及特异性分别为44.20%、96.30%，NO的AUC为0.867，P<0.001，其敏感性及特异性分别为95.30%、66.70%，显然NO评估AP患病的敏感性及特异性更高，HMGB1在评估病情严重程度中敏感性较NO低，但特异性却比NO高，总体来说，HMGB1和NO对评估是否患病的敏感性及特异性结果更为理想。造成这些结果的原因可能是，HMGB1作为一种具有高电泳迁移率的非组蛋白核蛋白，其生理功能和特性与它复杂的结构有关，它是由两个串联的折叠螺旋DNA以及包含一串谷氨酸和天冬氨酸的酸性尾巴组成，具有较高的流动性，当HMGB1释放到细胞外环境中时，可以引起全身炎症反应[2]。NO是可以在全身广泛分布的气体信号分子，在AP中充当气体递质，与HMGB1相比，它具有以下特点：①分子量小，分子结构简单，生物功能发挥快；
②它们是内源性合成、储存和分散在体内的；
③它们可以在不使用任何运输载体的情况下穿梭细胞膜[6]，基于这些特性，在炎症反应中，NO可能比HMGB1具有更强的流动性，分布更为广泛，因此NO在本研究的ROC曲线结果中敏感性更高，而HMGB1的结构特性则在某些方面赋予了更高的特异性。
为了解HMGB1表达与NO表达的相互关系，本课题组进行了相关性分析。结果发现，在SAP组中，血清 HMGB1及NO水平较对照组、MAP组明显升高，在SAP组中呈正相关，且相关性较强，而在MAP组、MSAP组中无明显相关性，说明在AP中，严重程度越高，HMGB1对促进NO的产生起到一定的作用，但具体机制仍待探究。HMGB1能与多种受体相结合，介导细胞炎症、免疫、增殖、迁移、自噬、凋亡，可能使NF-κB/MAPK活化，诱导NOS表达增加，提高NOS活性，间接促进炎性因子NO的产生[6，12]。这就导致SAP时，NO的浓度明显升高，其损伤作用在机体中表现为直接作用和间接作用。直接作用即引起难治性血管扩张，造成有效循环血容量减少，从而减少胰腺或者其他脏器血流造成缺血缺氧损伤，间接作用表现为大量NO与周围的氧自由基等物质反应而生成活性氮氧化物(reactive nitrogen oxide species，RNOS)，再由RNOS发挥NO的间接作用[13-15]。然而，在生理情况下，一定水平的NO浓度可以起到扩张微血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、神经元活动的重要介质的生物功能，介导一系列免疫病理过程[3，7，11]，这可能是本研究中MAP组、MSAP组的HMGB1与NO水平无明显相关性的原因。
综上所述，血清HMGB1及NO的表达水平有助于判断AP患者的严重程度，HMGB1可能通过正向调控NO表达参与SAP的发生发展。探讨HMGB1和NO的表达水平及相互关系，可为人们认识HMGB1及NO在AP发生发展中所扮演的角色提供一个全新的视角，也可能为AP的诊断和防治提供一个新的靶点。
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