王斯亮，罗序梅，张传溪,3*
（1.浙江大学农业与生物技术学院昆虫科学研究所，杭州 310058；
2.温州科技职业学院农业与生物技术学院，浙江 温州 325006；
3.宁波大学植物病毒学研究所，农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室/农业农村部和浙江省植物保护生物技术重点实验室，浙江 宁波315211）
神经肽广泛存在于低等和高等生物中，作为激素、神经递质、神经调质发挥生理功能。褐飞虱（Nilaparvata lugens）是我国南方稻区的首要害虫，主要吸食水稻叶鞘韧皮部的汁液，田间褐飞虱种群的为害造成“虱烧”现象，严重时会引起大面积水稻枯秆倒伏[1]。对于害虫的绿色防治，利用天敌、病原微生物以及特异性环境友好型农药是重要的方法。得益于褐飞虱基因组和转录组数据的解析以及褐飞虱系统性RNA干扰操作体系的建立[2-3]，褐飞虱的功能基因组的研究正在逐步开展，其中，分析鉴定得到的褐飞虱重要生理功能基因，具有成为防治褐飞虱的特异性农药靶标的潜力。神经肽在昆虫中承担着调控多种重要生理功能的作用，包括蜕皮、取食、求偶、繁殖、形体表观发育等[4-5]。一些神经肽（如影响蜕皮的神经肽）的功能缺失或失调会造成昆虫重要的形态或生理缺陷，或使昆虫死亡。
随着生物信息学的发展，越来越多的昆虫神经肽通过组学方法被识别。TANAKA等[6]通过对褐飞虱转录组的分析，搜索鉴别到一系列神经肽以及相应的G蛋白偶联受体的同源基因序列。与此相同，本研究对褐飞虱神经肽及其受体基因进行RNA 干扰，对神经肽生理功能进行筛查验证，期望得到具有敲减后致死致畸表型的神经肽基因，以及对尚未明确功能的神经肽进行功能分析。本文也概览了褐飞虱神经肽的生理功能，筛选出对褐飞虱存活率和发育有明显影响的神经肽及其受体基因，为害虫的绿色防控提供了新的潜在靶标。
1.1 供试虫源
褐飞虱试虫于2008 年采集自浙江大学华家池校区（30°16′35.21″ N，120°11′37.16″ E），传代饲养至今。用于饲养褐飞虱的水稻品种为‘秀水134’。饲养条件为：温度（25±1）℃，相对湿度60%～70%，光照周期16 h/8 h（光照/黑暗）。
1.2 序列查找
利用TANAKA 等[6]报道的褐飞虱神经肽及其受体基因cDNA 序列，通过Blast 2.2.29+程序，在褐飞虱转录组和基因组中搜索比对，并搜索可变剪接本的存在，通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）和克隆测序验证，得到用于设计双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）的褐飞虱神经肽及其受体基因的模板序列。
1.3 RNA 干扰（RNA interference,RNAi）
在特异性引物的5′端添加T7 启动子，利用MEGAscript T7 转 录 试 剂 盒（MEGAscript T7 Transcription Kit，美国Ambion 公司）合成目标基因的dsRNA（根据不同基因的开放阅读框长度，dsRNA 长度范围设计为200～500 bp），用无核酸酶的水将dsRNA溶液稀释为5 μg/μL。注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因的dsRNA（dsGFP）组作为阴性对照。使用FemtoJet显微注射仪（德国Eppendorf公司）将dsRNA注射到褐飞虱体内，每组选取50～100 头若虫进行注射，3 龄若虫每头注射20 nL，5 龄若虫每头注射100 nL。干扰后2～3 d取虫样提取总RNA，采用定量PCR验证干扰效果。为了排除实验中不同批次的水稻苗的营养条件差异造成的背景干扰，本研究采用“成虫相对存活率”来代表实验组中褐飞虱成虫的存活率，其中，成虫相对存活率=实验组成虫存活率/对照组成虫存活率。
1.4 总RNA 提取与反转录
采用Trizol 法提取褐飞虱的总RNA。利用cDNA 第一链反转录试剂盒［HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)］（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）合成cDNA第一链，反应体系为20 μL，加入1 μg总RNA进行反应。
1.5 荧光定量PCR 分析
用荧光定量PCR试剂盒（SYBR Green PCR Kit，美国Bio-Rad公司）制备荧光定量PCR反应体系，在Bio-Rad CFX-96实时荧光定量PCR仪中反应。内参基因为褐飞虱18S rRNA[7]（Nl18S，GenBank登录号为JN662398.1），正向引物为5′-CGCTACTACCGA TTGAA-3′，反向引物为5′-GGAAACCTTGTTACG ACTT-3′。荧光定量PCR 反应程序：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性10 s，60 ℃延伸30 s，40 个循环。每个基因进行3次生物学重复和3次技术重复。利用相对定量法2－ΔΔCT[8]计算各个基因的相对表达水平。
2.1 神经肽及其受体基因的功能筛查
通过PCR 扩增并验证得到了41 个神经肽基因（含1个可变剪接本）和44个受体基因。以褐飞虱3龄若虫代表低龄若虫，5龄代表高龄若虫，利用RNA干扰法沉默目标神经肽基因，随后观察褐飞虱表型。将阴性对照dsGFP注射入3龄若虫后，褐飞虱培养至成虫的存活率在0.6左右，而在注射5龄若虫后，培养至成虫的存活率在0.9左右。结果（表1）显示：在褐飞虱3 龄时进行注射，RNA 干扰后成虫相对存活率＜0.2的有4个神经肽基因，即NlCCAP［编码甲壳类动心肽（crustacean cardioactive peptide,CCAP）］、NlETH［编码蜕皮诱导激素（ecdysis triggering hormone,ETH）］、NlOKA［编码螯虾激肽（orcokinin,OK）］和NlPK［编码焦谷氨酸激肽（pyrokinin,PK）］。其余基因沉默后，成虫相对存活率都在0.6以上。在褐飞虱5 龄时进行注射，对所有基因进行RNA 干扰后成虫相对存活率＞0.5。NlCCAP和NlETH基因的沉默对低龄若虫具有剧烈的致死效果，但对高龄若虫的致死效果不明显。在低龄若虫中进行RNA 干扰造成高死亡率的基因有NlPK和NlOKA，而在高龄若虫中RNA 干扰此类基因却不具有致死效果，成虫相对存活率＞0.9。
表1 褐飞虱神经肽基因的RNA干扰效果Table 1 RNAi effects of neuropeptide genes in N.lugens
通过对神经肽基因功能的筛查验证，我们发现4 种神经肽基因NlETH、NlCCAP、NlPK、NlOKA经RNA干扰后可造成蜕皮阶段致死的表型。Nlburs-a和Nlburs-b（分别编码鞣化激素的2个亚基）受到干扰后，褐飞虱成虫无法展翅。神经肽基因Nlelevenin受到干扰后，褐飞虱体壁颜色黑化。在3 龄若虫阶段，上述这些神经肽基因沉默后产生明显的表型变化，而在5 龄若虫阶段受到干扰后表型变化不显著。
对受体基因进行RNA干扰发现，当干扰3龄若虫时，仅NlA36（PK 受体基因）和NlA46（鞣化激素受体基因）经干扰后成虫相对存活率＜0.2，其余均大于0.5。5 龄若虫中NlA46经干扰后成虫仍有较高的死亡率，其相对存活率约为0.3（表2）。对NlA42与Nlelevenin进行干扰后产生的褐飞虱表型变化一致，均为体壁黑化[9]。
表2 褐飞虱神经肽受体基因的RNA干扰效果Table 2 RNAi effects of neuropeptide receptor genes in N.lugens
表2（续） Continuation of Table 2
针对受RNA 干扰后产生明显外观变化的神经肽 及 其 受 体 基 因Nlburs-a、Nlburs-b、NlCCAP、NlETH、Nlelevenin、NlA36、NlA42和NlA46，我们分别设计了与原干扰片段不重叠的另一段干扰片段，通过观察干扰后产生的表型是否一致来验证是否存在脱靶效应。结果显示，所有基因在新双链RNA的干扰下产生的表型与原双链RNA的一致，且干扰效率均达到65%以上。
2.2 经典蜕皮相关神经肽在褐飞虱中的表现
2.2.1 蜕皮诱导激素（ETH）
对褐飞虱3龄若虫进行RNA干扰，发现NlETH沉默后，若虫主要在4 龄末和5 龄末蜕皮前死亡。对4 龄若虫注射dsNlETH，蜕皮前死亡的现象主要出现在5龄末；
对5龄若虫进行干扰，褐飞虱成虫只有约一半表现为蜕皮前死亡（图1）。
图1 褐飞虱在NlETH基因经RNA干扰后的存活率和表型Fig.1 Survival rates and phenotypes of N.lugens with NlETH knockdown after RNAi
2.2.2 甲壳类动心肽（CCAP）
本研究对褐飞虱3龄若虫注射dsNlCCAP后，发现其在4 龄至5 龄蜕皮以及5 龄至成虫蜕皮期间死亡，蜕裂线没有完全打开，整个虫体无法从旧皮中脱出（图2）。与NlETH相似，NlCCAP在褐飞虱中的沉默表型也表现为跨龄期的模式。对4龄若虫进行干扰，蜕皮受阻的表型主要出现在5 龄蜕皮至成虫阶段；
对5龄若虫进行干扰，则大部分褐飞虱能正常蜕皮羽化为成虫。
图2 褐飞虱在NlCCAP 基因经RNA 干扰后的存活率和表型Fig.2 Survival rates and phenotypes of N. lugens with NlCCAP knockdown after RNAi
2.2.3 鞣化激素
鞣化激素是由2个不同基因编码的亚基组成的神经肽类激素。在褐飞虱中，编码鞣化激素2 个亚基的基因分别为Nlburs-a和Nlburs-b。
在针对编码鞣化激素基因的RNA 干扰实验中，对Nlburs-a及Nlburs-b进行独立干扰时不影响另一个亚基的表达量（图3）。注射dsNlburs-a和dsNlburs-b产生的表型变化一致，均是造成成虫展翅不正常（图4）。在不同龄期干扰鞣化激素基因，均对褐飞虱的存活率没有显著影响，但产生的表型有所不同。在3龄若虫时期进行RNA干扰，褐飞虱发育至成虫时翅发育严重畸形，表现为无法正常伸展；
在4龄若虫时期进行干扰，成虫的翅仍无法正常伸展，但翅展面积比3龄若虫时期干扰时稍大；
而在5 龄若虫时期进行干扰，成虫翅面能伸展至透明状态，但仍有部分弯曲。随着注射的虫龄增加，干扰后产生的卷翅成虫的比例也越少（图5）。编码鞣化激素的基因经干扰后，褐飞虱表型呈现越低龄期进行干扰，受到的影响越严重。对鞣化激素的受体基因NlA46进行干扰，结果（图6）显示产生的外观表型与Nlburs-a和Nlburs-b沉默的效应一致，但不同的是成虫的死亡率较高，此时大部分成虫蜕皮后表皮柔软，鞣化过程明显受阻，最终死亡。该结果揭示了神经肽受体基因经RNA 干扰后产生的效应比配体基因受干扰后更剧烈。
图3 注射不同的dsRNA 后编码鞣化激素的2 个亚基的基因表达量变化Fig.3 Expression level changes of genes encoding two subunits of bursicon after injected with different dsRNAs
图4 褐飞虱在Nlburs-a和Nlburs-b基因经RNA干扰后的存活率和表型Fig.4 Survival rates and phenotypes of N. lugens with Nlburs-a and Nlburs-b knockdown after RNAi
图5 褐飞虱不同龄期干扰鞣化激素基因对成虫表型（A）及成虫卷翅率（B）的影响Fig.5 Effects of bursicon knockdown on phenotypes(A)and wing-unstretched rates of adults(B)in different instars of N.lugens
图6 褐飞虱在NlA46基因经RNA干扰后的存活率和表型Fig.6 Survival rates and phenotypes of N.lugens with NlA46 knockdown after RNAi
RNA 干扰应用于害虫防治是一种可行的策略[10]。本研究通过RNA 干扰方法对褐飞虱神经肽及其受体基因的生理功能进行筛查，以成虫相对存活率=0.5为界，发现在干扰3龄若虫时，在神经肽基因中，仅NlCCAP、NlETH、NlOKA和NlPK在褐飞虱3 龄阶段沉默后可造成存活率显著降低的现象；
受体基因中NlA36（PK 受体基因）和NlA46（鞣化激素受体基因）受干扰后成虫相对存活率＜0.5。然而CCAP的受体基因NlA27以及ETH的受体基因NlA6沉默后没有产生明显的表型变化。而这些在低龄若虫中被干扰产生致死现象的基因，在高龄（5 龄）若虫中被干扰时，除了NlA46外其余均没有产生明显的致死效果。
蜕皮是包括昆虫在内的节肢动物的重要生理过程。由于表皮以外骨骼的形式存在，个体的生长会受到阻碍，因此就需要在一定阶段脱去旧的表皮，使旧表皮内已经生长的躯体得到释放并形成新的表皮。前人的研究表明，蜕皮受多种激素、神经肽调控，包括蜕皮诱导激素（ETH）、甲壳类动心肽（CCAP）、促前胸腺激素（prothoracicotropic hormone, PTTH）、羽化激素（eclosion hormone, EH）等[11]。鞣化激素在昆虫中具有调控蜕皮后表皮鞣化的重要作用[12-13]。在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中，研究人员对ETH、EH、CCAP、鞣化激素相应的基因进行了干扰，发现它们在蜕皮的不同阶段（蜕皮前、蜕皮时、蜕皮后）中都扮演着重要的角色[14]。而在本研究中，NlCCAP和NlETH基因沉默后，褐飞虱表现出蜕皮受阻或蜕皮前死亡的现象，Nlburs-a、Nlburs-b与NlA46基因沉默后，褐飞虱表现出表皮柔软、无法正常展翅的现象。这些基因与在其他昆虫中报道的功能相似。而PTTH、EH等在其他昆虫中表现为对蜕皮有调控作用的神经肽，其在褐飞虱中的相应同源基因受干扰后没有产生明显的表型。另外几种褐飞虱中干扰后造成蜕皮受阻现象的基因为NlOKA（编码OK）、NlPK（编码PK）以及PK 的受体基因NlA36。OK 在家蚕中可以刺激前胸腺的活性，被认为可能是蜕皮激素的上游调控因子[15]。在长红猎蝽（Rhodnius prolixus）中，编码OK 的基因受干扰后也会造成蜕皮受阻[16]。而PK 的功能仍有很多未解之处，且在不同昆虫中功能差异很大，如在马德拉蜚蠊（Leucophaea maderae）中可引起后肠收缩[17]，在家蚕（Bombyx mori）中参与飞行肌的运动调控[18]，在麻蝇（Neobellieria bullata）中促进化蛹[19]，在甲虫中调控脏肌收缩和血糖水平[20]。在本研究中，首次发现PK在褐飞虱中与蜕皮有关，不过有关褐飞虱OK和PK的研究有待深入开展。
本研究通过RNA 干扰对褐飞虱神经肽及其受体基因进行了初步功能筛查，发现4 个神经肽基因（NlCCAP、NlETH、NlOKA和NlPK）和2 个受体基因（NlA36和NlA46）对褐飞虱的存活至关重要，具有成为害虫防治靶标的潜力，并初步概览了褐飞虱神经肽的生理功能。对RNA 干扰后未产生明显表型变化的神经肽及其受体基因，后续可以对其进行“组合干扰”[21]，观察这些基因之间是否存在功能互补等，以进一步理解褐飞虱神经肽/受体信号的调控网络。
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