张 欢，贾怡文，陈小威,2*，孙尚德,2*
1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.河南工业大学 河南省油料深加工工程研究中心，河南 郑州 450001
角鲨烯为三十碳六烯，由6个异戊二烯连接而成，是一种脂质不皂化物，也是一种天然直链三萜类化合物[1]。在大多数动植物体内角鲨烯均广泛存在，且在人皮脂中其含量高达50 mg/100 g[2]，这减少了紫外照射对人体皮肤的伤害[3]。角鲨烯还因具有抗氧化、滋润皮肤易被吸收、降低血清胆固醇、预防癌症和心血管疾病等特性，被广泛应用在保健品、食品及化妆品等领域[4-5]。
深海鲨鱼肝油是传统的获取角鲨烯的主要原料，它的角鲨烯含量约为50 g/100 g[6]。不同品种的深海鲨鱼肝油中存在不同含量的角鲨烯，这可能与其生活环境相关[7]。随着海洋资源的匮乏以及人们生态意识的提高，出于对海洋动物的保护，植物来源角鲨烯引起了人们的广泛关注[8-9]。角鲨烯在植物中分布较广，但含量并不高。植物油中橄榄油等虽可成为提取角鲨烯的来源，但这会加速人类食用油资源紧张，故从油脂精炼废弃物中提取角鲨烯是十分必要的[9]。脱臭馏出物是油脂精炼过程中脱臭得到的副产物。朱云[10]发现植物油精炼脱臭过程中，角鲨烯会在高温负压环境下迁移到馏出物中而富集。故橄榄油、米糠油、大豆油的脱臭馏出物可作为获取角鲨烯的优质植物源。如Akgün[11]以橄榄油脱臭馏出物为原料，在超临界甲醇中酯化后采用超临界CO2提取角鲨烯，此外，通过响应面分析优化提取条件可提取到纯度高达75%的角鲨烯。稻米油脱臭馏出物(DD)是稻米油精炼脱臭过程中产生的副产物，其中主要含有游离脂肪酸、植物甾醇、角鲨烯和维生素E等。稻米油脱臭馏出物中角鲨烯含量为2～10 g/100 g，高于大豆油脱臭馏出物(1～2 g/100 g)、棕榈油脱臭馏出物(0.5～0.8 g/100 g)等中的含量[12]。孙登文[13]采用多级逆流液-液萃取工艺从稻米油脱臭馏出物中提取维生素E和角鲨烯，得到纯度高达93.5%的角鲨烯，回收率为91.7%。Sugihara等[14]采用超临界CO2萃取与超临界硅胶色谱联用从稻米油脱臭馏出物中提取得到纯度81.0%的角鲨烯。
虽然这些技术提取角鲨烯的效果较好，但过程费时，操作复杂，成本昂贵[15-17]。因此，开发简单的工艺从稻米油脱臭馏出物分离、纯化角鲨烯具有重要意义，这将为角鲨烯提供植物源并促进脱臭馏出物副产物的高值化利用。基于此，作者以稻米油脱臭馏出物为原料，采用皂化-柱层析联用技术分离、纯化角鲨烯，探究皂化时间、皂化温度、碱浓度、料液比等确定皂化提取角鲨烯的最优条件，进一步选择合适的洗脱剂，利用柱层析技术得到高纯度角鲨烯，以期为角鲨烯分离、纯化及稻米油脱臭馏出物的高值化利用提供技术支持。
1.1 试验材料与试剂
稻米油脱臭馏出物：益海嘉里(武汉)粮油工业有限公司；
薄层色谱板、200～300目硅胶：青岛海洋化工有限公司；
角鲨烯标准品(纯度≥98%)：上海麦克林生化科技有限公司；
正己烷(色谱纯)，乙酸乙酯、丙酮、无水乙醇、95%乙醇(均为分析纯)，无水硫酸钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；
氢氧化钾：天津市凯通化学试剂有限公司。
1.2 试验仪器
7890B气相色谱仪、7890A-5575C气相色谱质谱联用仪：美国Angilent公司；
IKA RV10旋转蒸发仪器：德国IKA/艾卡广州仪器设备有限公司；
分析天平AUY200：日本SHIMADZU公司；
DRHH-SW4数显恒温磁力搅拌水浴锅：上海双捷实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 皂化分离
在250 mL磨口圆底烧瓶中称取稻米油脱臭馏出物约5.00 g(萃取剂量在单因素试验时取10.00 g)，并加入不同浓度和体积的碱液。在不同温度(50、60、70、80、90、100 ℃)下，冷凝回流不同时间(30、60、90、120、150、180 min)。通过冷凝回流管顶部加入25 mL(萃取剂量在单因素试验时取50 mL)蒸馏水，将反应物冷却至室温。随后，分3次用25 mL正己烷将反应物提取于250 mL分液漏斗中，振荡60 s后静置分层，得上层不皂化液。通过一定体积10%的乙醇水溶液分3次洗涤不皂化液，直至中性。如果在此过程中因剧烈震摇而出现乳化，用无水乙醇消除。最后，用无水硫酸钠除去不皂化液中的水分，有机相在50 ℃水浴中旋转蒸发溶剂，得到不皂化物。
1.3.2 薄层色谱试验
用玻璃毛细管吸取少量的角鲨烯标品溶液及不皂化液，将其均匀点样在薄层色谱板上，用不同种类、不同比例的展开剂分离，当其展开至色谱板顶端约1 cm时，取出薄层色谱板，晾干后用碘蒸汽进行显色反应。计算比移值(Rf)，当Rf在0.3～0.7之间且能将角鲨烯与其他物质分离的展开剂可作为柱层析的洗脱剂。
1.3.3 柱层析纯化
准确称取0.5 g不皂化物，以200～300目硅胶粉为固定相装柱，湿法上样，以正己烷为流动相，每25 mL为一管收集洗脱液，边洗脱边使用薄层色谱板及气相色谱判断洗脱液成分，待洗脱液中没有任何成分后，停止收集。通过气相色谱测定每管样品，根据标准曲线计算其中角鲨烯的纯度。合并收集到的角鲨烯洗脱液，在旋转蒸发仪中除去溶剂，可得角鲨烯纯化物。
1.3.4 气相色谱、质谱条件
气相色谱条件：SGE BPX-70色谱柱(30.0 m×250 μm×25.0 μm)；
采用程序升温，将初始温度设置为160 ℃，并以5 ℃/min升高至215 ℃，保持15 min；
氢火焰离子检测器温度300 ℃，进样口温度250 ℃，以高纯氮气为载气，流速1.0 mL/min，采用分流的方式进样，分流比10∶ 1，进样量1 μL。
质谱条件：HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；
采用程序升温，初始温度为160 ℃，并以15 ℃/min升高至220 ℃，保持2 min；
然后以5 ℃/min升高至280 ℃，保持20 min；
随后以5 ℃/min升温到 300 ℃，保持 2 min；
采用分流的方式进样，分流比10∶ 1，进样量1 μL；
载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min；
进样口温度250 ℃，四级杆温度150 ℃，离子源温度230 ℃，增益因子1.00；
电离方式为EI源，电离电压70 eV，选择采集方式为全扫描模式。
1.3.5 测定角鲨烯纯度和提取率
准确称取不皂化物0.5 g，用正己烷溶解并定容至10 mL，随后稀释10倍。用注射器得1.5 mL待测液，将其过0.45 μmol/L有机滤膜后利用气相色谱法测定。与此同时建立标准曲线。用正己烷将20 mg角鲨烯标准品定容至10 mL，配制2 mg/mL的角鲨烯母液，取不同体积母液稀释至一系列不同质量浓度(5、10、20、50、100、200、400 μg/mL)的角鲨烯标准溶液。以峰面积为横坐标(x)，质量浓度为纵坐标(y)，绘制角鲨烯标准曲线。以外标法定量，根据气相色谱及外标标准曲线，计算角鲨烯纯度和提取率。
1.4 数据处理
单因素试验每个样品进行2次平行，结果以平均值表示；
使用Origin 2019和SPSS 21软件进行数据处理与统计分析。
2.1 皂化单因素分析
2.1.1 萃取剂用量对角鲨烯纯度和提取率的影响
在皂化温度80 ℃、料液比1∶ 5 g/mL、碱浓度1.0 mol/L、皂化时间60 min的条件下，探究不同萃取剂用量对角鲨烯纯度和提取率的影响，其中采用50、30、20 mL正己烷萃取3次，50、30 mL正己烷萃取2次，50、35、20 mL正己烷分别萃取1次。
从图1可以看出，随着萃取剂用量增加，角鲨烯纯度呈显著降低趋势，从19.5%降至15.6%；
而提取率则与之相反，从68.7%升至94.7%，提升至1.4倍。这可能是因为萃取剂用量多，角鲨烯提取较为充分，但同时其他不皂化物也被更多提取出来，故角鲨烯纯度降低，提取率升高。这与胡光源等[18]研究结果萃取次数增加使角鲨烯提取率升高相一致。
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。图2—图5同。图1 萃取剂用量对角鲨烯纯度和提取率的影响Fig.1 Effect of extraction dose on the content and extraction rate of squalene
2.1.2 碱浓度对角鲨烯纯度和提取率的影响
在皂化温度80 ℃、料液比1∶ 5 g/mL、提取时间60 min、25 mL正己烷萃取1次的条件下，探究不同碱浓度(0.1～2.5 mol/L)对角鲨烯纯度和提取率的影响。从图2可以看出，随着碱浓度的增加，角鲨烯纯度呈先升高后降低趋势，由4.3%显著升高至19.0%又降至18.8%；
在2.0 mol/L时角鲨烯纯度最高。而提取率呈显著降低趋势，由96.7%降至76.4%。这是由于碱浓度较低时，皂化反应未进行彻底，反应体系中脂肪酸残留量高，并未被清洗除去，故角鲨烯在不皂化物中的纯度过低；
而碱浓度升高使皂化反应进行完全，角鲨烯从反应体系中分离而在不皂化物中被富集，从而不皂化物中的角鲨烯纯度升高；
当碱浓度超过2.0 mol/L时，角鲨烯纯度降低可能是由于谷维素、维生素E被破坏，不足以保护角鲨烯，这与陈璐等[19]、谢洋洋[20]的研究结果一致；
同时，过量碱液使角鲨烯被破坏，提取率持续降低[21]。综上，最佳碱浓度为2.0 mol/L。
图2 碱浓度对角鲨烯纯度和提取率的影响Fig.2 Effect of alkali concentration on the purity and extraction rate of squalene
2.1.3 料液比对角鲨烯纯度和提取率的影响
在提取温度80 ℃、碱浓度1.0 mol/L、提取时间60 min、25 mL正己烷萃取1次的条件下，探究不同料液比(1∶ 4、1∶ 5、1∶ 6、1∶ 7、1∶ 8、1∶ 9 g/mL)对角鲨烯纯度和提取率的影响，结果如图3所示。
由图3可知，角鲨烯纯度随着料液比的增加呈先升高后显著降低的趋势，这表明改变皂化过程中的料液比对角鲨烯纯度产生明显影响。在料液比为1∶ 6时角鲨烯纯度最高，为18.6%，此时皂化反应进行完全；
而料液比小于1∶ 6时，碱液过多，不皂化物被破坏，提取难度高，角鲨烯纯度降低。这与叶虔臻等[21]以山茶油脱臭馏出物为原料时的研究结果一致。但提取率并未呈现明显规律变化，主要是由于在此范围的料液比对角鲨烯纯度的影响不大，仅由17.9%升至18.6%。综上，最佳料液比为1∶ 6 g/mL。
图3 料液比对角鲨烯纯度和提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on squalene content and extraction rate
2.1.4 皂化时间对角鲨烯纯度和提取率的影响
在提取温度80 ℃、碱浓度1.0 mol/L、料液比1∶ 5 g/mL、25 mL正己烷萃取1次的条件下，探究不同提取时间(30、60、90、120、150、180 min)对角鲨烯纯度和提取率的影响。从图4可以看出，随着皂化时间的延长，角鲨烯纯度呈现缓慢升高后又逐渐降低的趋势，由18.7%升至19.0%，且在60 min时角鲨烯纯度最高，这说明提取时间对角鲨烯纯度并没有显著影响；
而提取率没有明显变化规律，但整体随着皂化时间的延长而降低。这主要是由于角鲨烯长期处于高温碱性体系中，易被破坏，纯度和提取率都有一定程度的降低。而当皂化时间少于60 min时，皂化反应不充分，不利于角鲨烯的纯度提高[19]。综上，最佳皂化时间为60 min。
图4 皂化时间对角鲨烯纯度和提取率的影响Fig.4 Effect of saponification time on the purity and extraction rate of squalene
2.1.5 皂化温度对角鲨烯纯度和提取率的影响
在碱浓度1.0 mol/L、料液比1∶ 5 g/mL，提取时间60 min、25 mL正己烷萃取1次的条件下，探究不同提取温度(50、60、70、80、90、100 ℃)对角鲨烯纯度和提取率的影响。由图5可知，当皂化温度从50 ℃升至70 ℃，角鲨烯纯度呈显著升高趋势，并在70 ℃时达到最高值18.48%，此后随着温度的继续升高，纯度随之显著降低，这与叶虔臻等[21]以山茶油脱臭馏出物为原料提取角鲨烯的结果一致。此外，齐德珍[22]采用皂化分离法以大豆油脱臭馏出物为原料提取角鲨烯，通过正交试验分析提取条件发现皂化温度以80 ℃为宜，这可能是由于大豆油脱臭馏出物中维生素E含量高于角鲨烯，且其抗氧化能力较角鲨烯好。故在同样高温情况下，大豆油脱臭馏出物中角鲨烯不易被破坏，其损失较稻米油脱臭馏出物中低[19,22-23]。皂化反应属于吸热反应。在低温皂化时，皂化反应慢且未完全，体系中脂肪酸含量高，角鲨烯纯度较低；
随着皂化温度的升高，皂化反应更充分，角鲨烯在不皂化物中富集，同时体系长期处于高温碱性条件下，角鲨烯损失量增多，在皂化温度超过70 ℃时角鲨烯提取率与纯度均降低。此外，角鲨烯热稳定性很差，易发生热分解反应，产生醛和酮[24-25]，也可能导致随着皂化温度的升高，角鲨烯提取率大体呈现降低趋势，由80.1%降至74.8%。综上，最佳皂化温度为70 ℃。
图5 皂化温度对角鲨烯纯度和提取率的影响Fig.5 Effect of saponification temperature on the purity and extraction rate of squalene
2.2 洗脱剂选择
选择不同种类、不同比例的展开剂，将石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮(极性从小到大)作为展开剂，并将其复配进行薄层色谱试验(TLC)，为防止拖尾现象，可加入一定量冰乙酸。从试验结果可知，单一溶剂乙酸乙酯、丙酮并不能将角鲨烯与其他物质分离，这主要是由于角鲨烯是不饱和三萜类化合物，属于弱极性物质，而薄层色谱试验根据相似相溶原则，极性较大的溶剂使之分离效果差[26]。当选择两种不同配比展开剂时，角鲨烯可与其他物质分离。其中，当V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)=10∶ 1、20∶ 1、25∶ 1、50∶ 1、100∶ 1时，比移值(Rf)在0.8～0.95之间，且相差不大。单一展开剂石油醚可使角鲨烯与其他物质分离，Rf为0.69。当展开剂选择正己烷时，分离效果较好(Rf=0.49)，因此选择正己烷作为洗脱剂进一步进行柱层析纯化角鲨烯。
2.3 柱层析纯化
目前，角鲨烯的定量测定多采用气相色谱法，而气相色谱-质谱联用法主要用于其定性分析[27-28]。由于皂化分离过程只能将角鲨烯纯度提升至20%左右，因此，为了得到高纯度的角鲨烯进一步利用柱层析技术提纯不皂化物。不皂化物、角鲨烯被洗脱之前的馏分以及含有角鲨烯的馏分气相色谱图如图6所示。将一定时间收集的馏出液进行气相色谱分析，可得每管中角鲨烯质量，并计算回收率，结果如图7所示。
图6 不皂化物以及柱层析第128、312分钟馏分气相色谱图Fig.6 Gas chromatograms of unsaponifiable matter and the 128 min and 312 min fractions of column chromatography
图7 洗脱时间对角鲨烯质量和回收率的影响Fig.7 Effect of elution time on the mass and recovery of squalene
从图6可知，不皂化物中除了角鲨烯外还含有其他不可皂化物(如甾醇、维生素E等)，随着正己烷的洗脱，杂质首先被洗脱出来，随后在240 min开始有角鲨烯流出。从图7可知，角鲨烯从层析240 min后开始富集，在304 min时质量最高，此后质量逐渐降低，360 min之后角鲨烯质量明显较低。通过柱层析收集240～360 min样品汇集后，脱溶能回收得到94%的角鲨烯。
插图为角鲨烯纯化物离子质谱及分子结构图8 角鲨烯纯化物气相色谱图Fig.8 Gas chromatographic results of purified squalene
利用气相色谱-质谱联用对得到的角鲨烯进行了结构鉴定分析，结果如图8所示。经离子色谱信息分析和质谱数据库匹配，证实得到的确实为角鲨烯。此外，利用标准曲线计算其纯度为85%。
以稻米油脱臭馏出物为原料，采用皂化分离法结合柱层析纯化制备角鲨烯。通过单因素考察可知，皂化提取高纯度角鲨烯的最适条件为皂化温度70 ℃、皂化时间60 min、料液比1∶ 6 g/mL、碱浓度2.0 mol/L。通过薄层色谱证实正己烷可作为柱层析分离纯化角鲨烯的最佳洗脱剂。经气相色谱分析，在柱层析收集液中获得了纯度为85%、回收率为94%的角鲨烯。本工艺操作简单，回收率较高，为植物源角鲨烯的开发利用提供了研究基础。
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