苏晓鹏 晏 军 张潞潞 李玲孺 党志博 李 玲 周怡驰 胡世平
(1 北京中医药大学东直门医院，北京，100700；
2 北京中医药大学，北京，100029；
3 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京，100700；
4 北京中医药大学深圳医院肝病科，深圳，518172)
原发性肝癌(Primary Hepatic Carcinoma，PHC)是指发生于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的一种常见恶性肿瘤，其发病率及病死率均较高，国际癌症研究署(International Agency for Research on Cancer,IARC)2018年报告指出肝癌发病率位于第6位，病死率位于第4位，男性癌性死亡位于第2位[1]。现代医学针对此病最有效的治疗方法是肝切除术、肝移植，但是该病起病较隐匿，早期症状不典型，且病情进展迅速，仅有不到30%的患者得到了最佳治疗[2]。绝大数患者错过最佳治疗时机，从而选择射频消融术(Radio Frequency Ablation,RFA)、经导管动脉栓塞化疗(Transcatheter Arterial Chemoembolization，TACE)以及放射治疗，这些治疗可以提高患者的生存率，但是在治疗过程均会产生一些不良反应，如发热、头痛、恶心、呕吐等[3]。
中医学对肝癌的认识历史悠久，内容丰富。肝癌的临床表现在中医古代文献中的记载散见于“伏梁”“肝积”“癥瘕”“积聚”“鼓胀”“肥气”等病，如《难经·五十六难》中记载“肝之积，名曰肥气。在左胁下如覆杯，有头足”。现代医家结合患者的临床表现，认为该病的病理性质为虚实夹杂，同时依据《黄帝内经》有“邪之所凑，其气必虚”和“壮人无积，虚人则有之”的理论,多数医家认为正气亏虚是该病发生的核心病机[4]。气是构成也是维持人体生命活动重要的物质，气一旦失常，可引起各种病理反应，如气虚血郁、气虚痰郁、气滞毒瘀等。因此在临床治疗时，大多医家以“扶正解毒”为大法治疗肝癌患者，皆取得较好的疗效[5-6]，同时在中西医结合治疗肝癌的研究中发现中医治疗可大大降低西药治疗的不良反应[7-8]。
针对肝癌的核心病机，临床医家常用黄芪扶正治肝癌[9]。黄芪性甘微温，质轻升浮，具有补气升阳、补脾益肝等功效。《本草纲目》记载“黄芪甘温纯阳，其用有五：补诸虚不足，一也；
益元气，二也；
壮脾胃，三也……活血生血”，由此可见黄芪乃“补气之长”。此外重用黄芪还有利于增强肝的疏泄功效，名医张锡纯在《医学衷中参西录》中讲到“肝属木而应春令，其气温而性喜条达，黄芪之性温而上升，以之补肝原有同气相求之妙用”。在黄芪扶正基础上加用丹参治疗肝癌之“毒”，丹参性苦，微寒，具有活血祛瘀、消肿止痛等功效。前人有“一味丹参，功同四物”之说，可见其活血而不伤正气，用其治疗肝癌本虚有瘀毒者最为合适，再者黄芪配合丹参，可以使黄芪补而不滞。黄芪和丹参治疗肝癌以及其他肿瘤的药理学研究较多[10-12]，但是黄芪和丹参药对是如何发挥抗肝癌的作用机制仍未阐明，本研究借助网络药理学的方法，以黄芪-丹参-肝癌为研究对象，构建中药药对、化学成分、基因靶点、相关通路之间的关联性，初步揭示黄芪-丹参治疗肝癌的作用机制，并通过体外实验验证相关作用机制。
1.1 材料
1.1.1 细胞 人肝癌细胞HepG2,由中国科学院基因所馈赠，并由上海富衡生物科技有限公司鉴定，鉴定编号:20171012-01。
1.1.2 药物 黄芪-丹参药对药液：黄芪30 g、丹参20 g。均购自三九药业，批号分别为：2101002W、2012007W。取称量纸一张，用电子天平称取0.5 g黄芪-丹参颗粒溶解于10 mL细胞高糖培养基中，用10 mL注射器与0.22 μm除菌过滤器将溶解好的液体过滤至新的15 mL离心管中，即为黄芪-丹参药对药液，存于4 ℃冰箱。
1.1.3 试剂与仪器 澳洲胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)高糖培养基(Gibco，美国，批号：1009-141、C11995500BT)；
0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid，EDTA)(北京鼎国生物技术有限公司，批号：GP3108-100ML)；
Cell Counting Kit-8(北京兰博利德生物公司，批号：CK001-500T)；
Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒[凯基生物(KeyGEN)公司，批号：KGA108-1]；
实时PCR试剂盒(中国全式金公司，批号：AQ131-01)；
超净工作台(广州展晨生物科技有限公司，型号：SW-CJ-1FD)；
CO2培养箱(三洋电机株式会社，日本，型号：SANYOXD-101)，细胞流式仪(BD公司，美国,型号：C6)；
PCR仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司，型号：C1000]。
1.2 方法
1.2.1 黄芪-丹参药对的活性成分收集 本研究依据中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp)以Herb name检索方式搜集黄芪、丹参药对的活性成分[13]。并依据成分毒药物动力学(Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME)将搜集到的活性进行筛选，筛选条件为口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18。除此之外查阅相关文献补充数据库的不足。
1.2.2 建立黄芪-丹参药对活性成分基因靶点库及相应网络构建 将筛选出来黄芪-丹参有效成分分别带入TCMSP平台的Related Target中，搜集相应的标准蛋白名。随后利用Unitprot(https://ebi14.uniprot.org)数据库查询靶点的标准蛋白和基因名，并对黄芪-丹参药对的标准蛋白进行相应的基因匹配。
1.2.3 肝癌疾病相关靶点的收集 在Drugbank数据库(https://go.drugbank.com)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)、治疗性靶标数据库(Therapeutic Target Database，TTD)、人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org)系统中以“Liver Cancer”为检索词查询肝癌疾病基因靶点，将上述数据库检索的基因靶点汇总并删除重复值。
1.2.4 核心靶点基因蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络构建 将黄芪-丹参药对与肝癌疾病的交集靶点上传至String 11.0(http://string-db.org)数据库构建PPI网络，调制物种名为“Homo Sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，其余设置选项设为默认值后进行药物成分蛋白和疾病蛋白的相互作用分析，随后将得到的PPI通过Cytoscape 3.8.0软件达到网络的可视化，并进行网络分析。
1.2.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 使用Metascape(http://metascape.org)数据库对黄芪-丹参药对作用于肝癌的潜在靶点进行GO与KEGG富集分析，设置阈值P<0.05，初步预测黄芪-丹参药对治疗肝癌的相关作用机制。运用Metascape数据库，从生物过程(Biological Processes，BP)、分子功能(Molecular Functions，MF)、细胞组分(Cellular Components,BC)3个方面对黄芪-丹参药对治疗肝癌的交集基因进行CO功能富集分析。
1.2.6 CCK-8法检测细胞活力 将96孔板分为9组，每组6个复孔。第1组为无细胞的空白对照，第2组为无药液的纯细胞对照组，黄芪-丹参药液对应的余下8组分别为：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、400 mg/L。随后用已孵育48 h的细胞计数种板，每孔1万个细胞于100 μL培养基，每组先配制好该组所需要孔数的细胞悬液和药液再进行种板。96孔板种好后放入二氧化碳培养箱中孵育。48 h后，将提前融化好的CCK-8溶液于每孔中加入10 μL，于培养箱中孵育2～4 h；
2～4 h后，用荧光化学发光仪中的Ascent Software Version 2.6软件在450 nm波长处测定吸光值，进行荧光强度数据的读取和保存。
1.2.7 Annexin V-FITC法检测细胞凋亡 细胞培养48 h后用不含EDTA的胰酶消化2 nim，随后用含血清培养基终止胰酶消化，以1 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心5 min后弃上清，并用1 mL磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗1～2次，再次以1 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心5 min后弃上清液；
用1 mL 1×结合缓冲液Binding Buffer加入离心管并重悬细胞,使细胞的密度达到1×106个/mL。随后向预先标记好的流式管中加入100 μL细胞(1×105个)，并依次向流式管内加入5 μL Annexin V-FITC，室温避光后再加入10 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide,PI)，室温避光，染色5 min，最后向管内加入PBS保证每个流式管的含细胞液体体积为500 μL，轻轻混匀。在1 h内用流式细胞仪检测。
1.2.8 PCR实验检测基因 根据样本数计算所需板孔，每个样本做3个复孔。稀释样本：稀释5倍，加DEPC水80 μL于逆转录好的cDNA中并混匀。引物稀释：按照引物说明书稀释引物。配制混合物：每孔：前引物1 μL，后引物1 μL，TBGreen 10 μL，H2O 6 μL，共18 μL。根据排板，每孔加入2 μL cDNA样本和18 μL上述配好的混合物。震荡混匀，上机反应、检测。使用两步法PCR扩增标准程序。2-△△Ct法计算相对量为结果进行统计分析。引物序列见下表1。
表1 实时PCR引物序列
2.1 黄芪丹参药对活性成分筛选结果 得到黄芪有效成分20个，黄芪活性成分22个。丹参活性成分65个，其中黄芪无靶点活性成分5个，丹参无靶点活性成分6个，最终筛选得到76个活性成分。见表2。随后利用Cytoscape绘制中药-成分-靶点图，绘制过程计算Degree值，通过比较Degree值大小后发现槲皮素、毛蕊异黄酮、没食子酸酯、丹参新醌为主要活性成分。见图1。
表2 黄芪-丹参主要活性成分及OB和DL值
续表2 黄芪-丹参主要活性成分及OB和DL值
续表2 黄芪-丹参主要活性成分及OB和DL值
图1 黄芪-丹参有效成分-靶点网络
2.2 黄芪-丹参药对治疗肝癌的靶标筛选 删除重复靶点后黄芪丹参药对共216个靶点。通过多个疾病靶点数据库以“Liver Cancer”为检索词检索共获得1 310个靶点。最后通过构建韦恩图，从中获得黄芪-丹参药对和肝癌疾病共同靶点118个，即核心靶点。见图2。
图2 黄芪-丹参药对与肝癌疾病的韦恩图
2.3 PPI网络的构建 共形成283个PPI关系对，平均连接度为6.99。见图3。处于节点度前10位的蛋白为AKT1、JUN、MAPK1、MAPK8、IL6、MAPK14、FOS、ESR1、EGFR、CCND1。这些靶蛋白可能是黄芪-丹参药对治疗肝癌的最为紧要的核心靶点。
图3 黄芪-丹参药对与肝癌疾病核心靶点PPI网络
2.4 GO功能富集分析 黄芪-丹参药对主要参与的生物过程为对细胞凋亡信号的应答过程(Apoptotic Signaling Pathway)、对无机物质的应答(Response to Inorganic Substance)、细胞对有机环状化合物的应答(Cellular Response to Organic Cyclic Compound)、对有毒物质的反应(Response to Toxic Substance)、细胞对脂质的应答(Cellular Response to Lipid)。分子功能集中在转录因子结合方面(Transcription Factor Binding)，其细胞组分主要集中在膜筏(Membrane Raft)和转录因子(Transcription Factor Complex)。见图4。
图4 GO(BP、CC、MF)功能富集分析柱状图
2.5 KEGG富集分析 结果显示黄芪-丹参药对主要通过作用于癌症相关通路(Pathways in Cancer)、乙型肝炎相关通路(Hepatitis B)、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、PI3K-AKT通路、HIF-1信号通路等治疗肝癌。见图5。
图5 KEGG分析富集气泡图
2.6 黄芪-丹参药对HepG2肝癌细胞活力影响 48 h后的细胞活力除25 mg/L、50 mg/L组对细胞活力无影响外，其余组均有影响，差异有统计学意义(P<0.01)。见图6。其中150 mg/L组以后细胞活力均小于50%，故选用150 mg/L、300 mg/L作为黄芪-丹参药对低和高剂量。
图6 黄芪-丹参药对对HepG2细胞活力48 h的影响(n=6)
2.7 黄芪-丹参药对对HepG2肝癌细胞凋亡影响 黄芪-丹参药对对HepG2细胞的48 h凋亡率的影响通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测，与空白组发现黄芪-丹参药对可以促进肿瘤细胞凋亡，且对肿瘤细胞的凋亡率具有药量依赖性.见表3、图7。
表3 黄芪-丹参药对对HepG2细胞凋亡率(%,n=3)
图7 黄芪-丹参药对对HepG2细胞凋亡48 h的影响
2.8 黄芪-丹参药对PI3K、AKT基因的影响 通过实时PCR技术分析黄芪-丹参药对干预48 h后对HepG2细胞的PI3K/AKT信号通路相关基因PI3K及AKT的mRNA表达的影响。与空白组对比发现，黄芪-丹参药对低剂量和高剂量预均可下调PI3K及AKT的mRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4。
表4 黄芪-丹参药对对PI3K/AKT信号通路相关基因mRNA相对表达
随着肝癌的患病率、病死率逐年增高[1]，针对“肝癌”的相关研究越来越多，中医学具有悠久的历史，且在实践治疗中起到了非常重要的作用，备受研究者重视。中药成分具有抗癌的作用。本研究发现黄芪-丹参药对在治疗肝癌中发挥作用的主要成分是槲皮素、毛蕊异黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯、丹参新醌。周孟等[15]通过动物实验证明，槲皮素可抑制体内外HepG2肝癌细胞的增殖并会促进其发生凋亡，除此之外还发现槲皮素的不良反应几乎为零。陈丽等[16]通过细胞实验证明表没食子儿茶素没食子酸酯通过下调肝癌细胞的自噬从而有效抑制癌细胞增殖、促进癌细胞死亡。毛蕊异黄酮、丹参新醌同样也被证实有抗癌的作用[12]。除此之外，本研究筛选后得到黄芪丹参药对治疗肝癌的靶点共118个，体现了黄芪丹参药对治疗肝癌具有多成分、多靶点协同作用的特点。
通过构建的PPI网络对118个靶点进一步研究发现黄芪丹参药对治疗肝癌的基因靶点相互作用密切，主要参与的基因靶点包括：AKT1、JUN、MAPK1、MAPK8、IL-6、MAPK14、FOS、ESR1、EGFR、CCND1。AKT1是一类蛋白激酶，主要影响细胞的增殖和生长，研究表明其具有调控肝癌细胞增殖的功效[17]。白细胞介素-6作为炎症介质，除参与炎症反应外，近几年研究发现白细胞介素-6通过参与肝癌微环境构成、调控下游转录因子、激活相关通路等影响肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，据此也成为肝癌靶向治疗的一个热点[18]。MAPK1、MAPK8、MAPK14均为MAPK家族的一员，现代研究发现MAPK信号通路是细胞内非常重要的信号通路，不仅参与正常组织细胞的增殖、分化、凋亡等生理过程，而且也参与各种肿瘤的病理过程[19]。JUN、ESR1皆为染色体上的基因，JUN编码一种与病毒蛋白高度相似的蛋白，在我国慢性乙型肝炎病毒感染是肝癌的主要病因，研究发现，85%肝癌患者乙型肝炎病毒感染阳性[20]。ESR1编码雌激素受体，研究表明肝脏中雌激素在与雌激素受体结合后才具有抗氧化、抗肝纤维化、抗癌等功效[21]。表皮生长因子受体是人表皮生长因子受体家族成员之一，研究发现表皮生长因子受体过表达可引起肝癌，西妥昔单抗通过抑制表皮生长因子受体及其受体结合发挥抗肿瘤作用。此外体外细胞实验证明黄芪丹参药对可以抑制HepG2细胞活力。因此，黄芪丹参药对可能主要通过影响肝癌细胞增殖以及促进相关受体结合发生抗肝癌的作用。
GO富集分析后发现：黄芪丹参药对主要细胞组成集中在膜筏和转录因子上，而分子功能也集中在转录因子结合方面，主要参与了细胞凋亡信号的应答过程。KEGG通路富集分析结果提示黄芪丹参药对主要通过癌症相关通路、乙型肝炎相关通路、TNF信号通路、PI3K/AKT信号通路等发挥抗癌作用。研究表明，某些转录因子通过调控增殖和凋亡相关基因，进而调节肿瘤的发生发展[22]。本研究发现黄芪丹参药对治疗肝癌的核心靶点包括促分裂原活化的蛋白激酶1、促分裂原活化的蛋白激酶8、促分裂原活化的蛋白激酶14，皆参与细胞的增殖、凋亡，同时还参与了肿瘤的病理过程，这恰恰与KEGG富集结果中黄芪丹参药对通过癌症相关通路起效相互印证。Jun激酶编码病毒蛋白，或许黄芪丹参药对正是通过乙型肝炎相关通路抑制Jun激酶的作用降低乙型肝炎病毒感染发挥作用，这样在抗肝癌的治疗过程中还可以起到抗病毒的作用，现代药理学研究也证实二者可以抗乙型肝炎病毒[23]。PI3K/AKT信号通路近年来被视为调节肿瘤的主要通路[24]，本研究发现黄芪丹参药对可以减少PI3K和AKTmRNA的表达，由此可见黄芪丹参药对发挥抗肿瘤作用与该通路密切相关。
总之，经网络药理学分析后，黄芪丹参药对治疗肝癌具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，可以确定中药疗效的客观性。经体外细胞实验初步明确黄芪丹参药对可以抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡，并且与PI3K/AKT信号通路密切相关。但是仍需要进一步通过细胞实验或动物实验对该药对成分以及其他靶点、通路进行验证，为中药治疗肝癌提供更加有力的证据，以便使中药更好地运用于肿瘤治疗中。
猜你喜欢丹参靶点黄芪丹参“收获神器”效率高今日农业(2022年4期)2022-11-16“补气之王”黄芪，你吃对了吗？今日农业(2022年13期)2022-09-15维生素D受体或是糖尿病治疗的新靶点中老年保健(2021年3期)2021-12-03肿瘤免疫治疗发现新潜在靶点中国生殖健康(2020年7期)2020-12-10丹参叶干燥过程中化学成分的动态变化中成药(2019年12期)2020-01-04黄芪是个宝海峡姐妹(2019年3期)2019-06-18丹参叶片在快速生长期对短期UV-B辐射的敏感性中成药(2018年11期)2018-11-24带鱼黄芪汤缓解胃下垂特别健康(2018年4期)2018-01-28心力衰竭的分子重构机制及其潜在的治疗靶点医学研究杂志(2015年7期)2015-06-22氯胺酮依赖脑内作用靶点的可视化研究同位素(2014年2期)2014-04-16
