孙国强，董金颖，董建生，郜晋阳
(山西瑞芝生物科技有限公司，山西 运城 044000)
灵芝(Ganodermalucidum)也叫瑞草、仙草等，为名贵的药用真菌[1]。现代研究表明，其具有调节免疫力、抗肿瘤、抗衰老、保肝、提高机体耐缺氧能力等活性[2-6]。灵芝子实体和菌丝体中均含蛋白质、核苷类、糖类、三萜类、甾醇类、生物碱、挥发油等多种化学活性成分。其中，三萜类化合物是其主要有效成分之一，灵芝是传统的药食同源品种之一[2，4，7]。《中国药典》采用紫外-可见分光光度法对灵芝中三萜及甾醇含量进行测定[8]。
由于通过液体或固体发酵技术获取灵芝三萜类化合物具有生产周期短、不受季节影响、可大批量生产、含量相对稳定等特点，现已成为生产灵芝三萜类化合物的最有效方法[9-10]。当前，市场上有众多灵芝菌丝类产品，其宣传的保健功能与灵芝类似，但三萜及甾醇等主要活性成分的检测方法尚未有统一的国家标准[11-12]。目前，国内外对灵芝子实体、菌丝体和孢子中三萜的研究较多，但菌丝体中三萜及甾醇含量的相关报道较少[9]。本研究较系统地建立了灵芝菌丝体中三萜及甾醇的含量检测方法，以期为灵芝菌丝类产品质量标准制定及产品深度开发提供参考。
1.1 材料与试剂
1.1.1 灵芝菌丝粉 灵芝菌丝粉由山西瑞芝生物科技有限公司培养的灵芝菌丝体，经再干燥粉碎后制备。
1.1.2 齐墩果酸对照品 齐墩果酸对照品,批号：110709-201808，中国食品药品检定研究院。
1.1.3 主要试剂 香草醛(批号：20150701，国药集团化学试剂有限公司)、冰醋酸(批号：181128，四川西陇科学有限公司)、95%乙醇(批号：180619，四川西陇科学有限公司)、乙酸乙酯(20170308，四川西陇科学有限公司)、甲醇(批号：20180307，广东光华科技股份有限公司)、高氯酸(批号：2017034，天津市鑫源化工有限公司)，均为分析纯；
水为双蒸水。
1.2 主要仪器
UV-1100紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；
AL204电子天平(瑞士梅特勒公司)；
HH-S4数显恒温水浴锅(常州市国旺仪器制造有限公司)；
DK-615HTD超声波清洗器(深圳市得康洗净电器有限公司)。
紫外-可见分光光度法[8，12-16]常用于灵芝类产品中三萜及甾醇含量测定，本研究选用此法，对其在灵芝菌丝粉中三萜及甾醇含量测定的适用性进行系统研究。
2.1 5%香草醛-冰醋酸制备
精密称取0.501 02 g香草醛，加冰醋酸溶解并定容至10 mL，混匀，临用新配。
2.2 齐墩果酸对照品溶液制备
精密称取齐墩果酸对照品0.011 60 g，加甲醇溶解且定容至50 mL，即得0.211 4 mg·mL-1的齐墩果酸标准溶液。
2.3 供试品溶液制备
取本品粉末约1 g(m1)，精密称定，置具塞锥形中，加乙醇30 mL，超声处理45 min，滤过，滤液置50 mL(V1)量瓶中，用适量乙醇，分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。
2.4 空白制剂溶液制备
精密称取约1 g混合均匀的空白制剂，按“2.3”项下供试品溶液制备方法，同法制备，即得。
2.5 样品测定
精密量取供试品溶液0.2 mL(V2)，置15 mL具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，摇匀，在70℃水浴中加热15 min，立即置冰浴中冷却5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，摇匀，以相应试剂为空白，按紫外-可见分光光度法，在546 nm波长处测定吸光度A，由标准曲线上计算出样品测定液中三萜及甾醇质量m(mg)，计算，即得。
三萜及甾醇含量计算公式：
式中：X：样品中三萜及甾醇含量[g/100 g]；
m1：样品取样量(g)；
V1：样品定容体积(mL)；
V2：量取供试品溶液体积(mL)；
m：样品测定液中三萜及甾醇的质量(mg)。
2.6 测定波长选择
精密量取“2.2”项下齐墩果酸对照品溶液0.2 mL，按“2.5”项下方法处理即得标准品测定液，将标准品测定液与“2.4”项下空白制剂溶液于紫外分光光度计500～700 nm波长范围进行紫外扫描，记录紫外扫描图(见图1)。
图1 标准品、空白溶液紫外扫描图
从图1可以看出，齐墩果酸标准品在547 nm处有最大特征吸收峰，而空白制剂溶液在(546±2) nm波长处无吸收。这表明本品选择546 nm作为测定波长具有专属性，空白制剂溶液对检测结果无干扰。
2.7 方法学考察
2.7.1 线性关系 精密量取浓度为0.211 4 mg·mL-1的齐墩果酸对照品溶液0 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL(相当于葡萄糖0.000 00 mg、0.021 14 mg、0.042 28 mg、0.063 42 mg、0.084 56 mg、0.105 70 mg、0.126 84 mg、0.147 98 mg、0.169 12 mg)分别置入15 mL具塞试管中，按照“2.5样品测定”项方法处理且测定吸光度，结果见表1。
表1 线性关系检测结果
以齐墩果酸质量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，见图2。
图2 齐墩果酸线性范围标准曲线
从图2可以得到，线性方程为y=10.496x-0.022 4，R2=0.999 3。这表明三萜及甾醇质量在0～0.169 12 mg范围内线性关系良好。
2.7.2 精密度试验 按“2.7方法学考察”平行称取6份供试品，测定并计算三萜及甾醇含量，结果见表2。
表2 精密度试验结果
从表2可以看出，6份供试品的三萜及甾醇平均含量为2.402 2%，RSD为0.73%<2%，这表明此方法精密度良好。
2.7.3 稳定性考察 精密称取本品1.065 41 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，后按“2.5样品
测定”项方法处理，处于室温下放置，1 h 内每隔10 min测定1次吸光度值，后续于2、4、6、8、12 h各测定1次吸光度值，结果见表3。
表3 供试品溶液稳定性考察结果
以测定时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制稳定性考察曲线图，见图3。
图3 供试品溶液稳定性考察曲线
结合表3、图3看出，供试品溶液吸光度值在1 h内基本稳定，RSD为0.23%<2%，1 h后吸光度值显著升高，稳定性明显下降，因此配置好的供试品溶液应在1 h内完成吸光度测定。
2.7.4 准确度考察 分别平行精密称取已知三萜及甾醇含量约为2.4%的样品3组，每组约0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。每组分3管，共9管，各取0.2 mL供试品溶液。第一组按供试品溶液所含三萜及甾醇质量的约50%添加“2.2”项下齐墩果酸对照品、第二组按供试品溶液所含三萜及甾醇质量的约100%添加“2.2”项下齐墩果酸对照品、第三组按供试品溶液所含三萜及甾醇质量的约150%添加“2.2”项下齐墩果酸对照品(即分别添加浓度为0.211 4 mg/mL的齐墩果酸标准液0.12 mL、0.23 mL和0.35 mL)，与供试品溶液混合后按“2.5”项下方法处理并测定吸光度，计算加标回收率，结果见表4。
加标回收计算公式：
表4 加标回收率结果
从表4可以看出，三萜及甾醇的平均加标回收率为101.99%，RSD为1.44%<2%，加标回收率符合规定，表明此方法准确度良好。
取三批产品试样，每批产品平行取两份样品。精密称取样品约1 g，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.5样品测定”方法测定吸光度值并按照“2.5样品测定”中公式计算三萜及甾醇的含量，结果见表5。
表5 样品中三萜及甾醇含量检测结果
从表5可以看出，三批次产品试样每一批次产品的三萜及甾醇含量均在2.4 g/100 g左右，且批次内的RSD值均<2%，表明此方法准确、稳定、可靠。
本研究结果表明，紫外-可见分光光度法测定灵芝菌丝中三萜及甾醇含量，在0～0.169 12 mg范围内线性关系良好，精密度RSD为0.73%。样品溶液在配制后1 h 内稳定性较好，平均加标回收率为101.99%，RSD为1.44%。此方法适用于测定灵芝菌丝体中三萜及甾醇含量。
灵芝菌丝体含有与灵芝相同的三萜及甾醇，具有广泛的生理活性和良好的应用前景，且通过发酵生产，产量大，周期短，常年可行，这使其很可能成为灵芝类产品开发的又一重点[9-10，17]。尽管目前色谱法和紫外-可见分光光度法均广泛用于灵芝三萜及甾醇含量测定，但色谱法未收载于《中国药典》和国家农业农村部颁布的相关标准[8，12-16，18]。因此，在制定灵芝菌丝类产品统一的质量标准时，应优先采用紫外-可见分光光度法测定其三萜及甾醇含量。
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