王晓杰，曲 悦，刘晓兰
(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院；
黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，齐齐哈尔 161006)
随着经济的发展，消费者越来越关注食品的营养质量，以期通过营养食品的摄入促进健康、减少疾病和延长寿命[1]。肽是蛋白质的一种特殊存在形式，一般为蛋白质降解过程中的中间产物，其分子结构介于氨基酸和蛋白质之间。通过食物蛋白质的酶促水解而衍生的生物活性肽因其促进健康的功能而引起了广泛的关注[2]。但是，与内源性肽(例如肽激素或信号肽)不同，食物来源的生物活性肽在经口服用后必须吸收到血液循环中，并输送至靶标才能发挥其体内生物活性[3]。因此，生物活性肽能否被机体消化、吸收与利用，是其在体内发挥健康功效的关键影响因子。
玉米糖肽是玉米蛋白先经蛋白酶水解获得的低分子质量玉米肽，再在转谷氨酰胺酶(TGase)催化下与氨基糖共价结合的产物。与玉米肽相比，玉米糖肽的溶解性显著增加，而且具有更高的抗氧化活性及乙醇脱氢酶激活活性[4,5]，是潜在的抗氧化剂和酒精代谢促进剂。研究表明：生物活性肽的结构特性(如分子质量大小、带电性质、疏水性等)会影响其在动物胃肠道内的稳定性及吸收性能，进而影响活性肽的营养质量[6,7]。傅里叶红外光谱的研究结果表明，在TGase催化的酶法糖基化反应中，D-氨基葡萄糖的共价结合使玉米肽的结构特性发生改变[5]，这种改变是否会影响玉米糖肽的营养特性，需要进行深入研究。
本实验以玉米醇溶蛋白源玉米肽为研究对象，采用D-氨基葡萄糖和TGase对其进行酶法糖基化修饰制备玉米糖肽，采用模拟人体胃肠部消化环境的体外消化模型和大鼠体内实验，分析玉米糖肽的消化、吸收性能，从营养特性角度去评价玉米糖肽的营养质量，为在细胞和动物水平上研究玉米糖肽的健康功能提供参考。
1.1 材料与试剂
D-氨基葡萄糖；
碱性蛋白酶Alcalase，酶活力6.28×105U/mL；
TGase，酶活力1 000 U/g；
玉米醇溶蛋白；
胃蛋白酶；
胰蛋白酶；
配方鼠粮；
SD大鼠。
1.2 仪器与设备
PB-10 pH计，NDA701杜马斯定氮仪，LD-53真空冷冻干燥机，TGL-16C-W台式高速离心机，L-8900全自动氨基酸分析仪。
1.3 方法
1.3.1 玉米糖肽的制备
玉米醇溶蛋白用蒸馏水配成底物质量浓度为5%的悬浮液，按酶与底物的质量比3%加入碱性蛋白酶Alcalase，在初始pH8.5、温度60 ℃条件下酶解2 h。在酶解过程中，不断加入1.0 mol/L NaOH使pH保持在8.5。酶解结束后，反应液放入沸水浴中灭酶15 min，冷却至室温后将pH调至7.0，4 000 r/min离心10 min，收集上清液经冷冻干燥后获得玉米肽。将制备的玉米肽配成质量分数为3%的溶液，按玉米肽与D-氨基葡萄糖的质量比1∶3加入D-氨基葡萄糖，用2 mol/L NaOH调节pH至7.7，按加酶量55 U/g蛋白加入TGase，在44 ℃恒温水浴振荡器中糖基化反应7 h，85 ℃水浴灭酶5 min。冷却至室温，4 000 r/min离心10 min，收集上清液过截断分子质量300 u的纳滤膜，收集透过液经冷冻干燥后获得玉米糖肽[8]。该方法制备的玉米糖肽中D-氨基葡萄糖质量分数为(14.92±2.43)%。
1.3.2 玉米糖肽体外营养质量的研究
1.3.2.1 蛋白质含量的测定
采用微量凯氏定氮法[9]。
1.3.2.2 肽含量的测定
参照Milán-Carrillo 的三氯乙酸沉淀法[10]，略有修改。将10 mL、10%三氯乙酸溶液与等体积玉米糖肽溶液混合，于25 ℃、120 r/min的恒温水浴振荡器中保温1 h。10 000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白质质量，按式(1)计算肽含量。
(1)
1.3.2.3 体外消化率的测定
一步消化：取10 mL蛋白质量浓度为50 mg/mL的玉米糖肽和玉米肽溶液，将pH调节至2.0后加入10 mg胃蛋白酶，于37 ℃条件下消化2 h。
二步消化：制备玉米糖肽和玉米肽的一步消化产物，调节消化液的pH至8.0，加入30 mg胰蛋白酶，于37 ℃条件下消化1 h。
一步和二步消化结束后，反应液置于90 ℃水浴中灭酶5 min，冷却至室温，再分别加入等体积10% 三氯乙酸溶液，于25 ℃、120 r/min的恒温水浴振荡器中振荡反应1 h，10 000 r/min离心10 min，收集一步和二步消化液测定蛋白质含量，按式(2)计算体外消化率。
(2)
1.3.2.4 玉米糖肽分子质量分布的测定
采用配有凝胶层析色谱柱Superdex Peptide10/300 GL的蛋白质纯化系统测定。色谱柱先用蓝色葡聚糖2000测定外水体积V0，用标准蛋白(aprotinine, 6 500 u；
杆菌肽, 1 400 u；
氧化型谷胱甘肽, 612 u；
还原型谷胱甘肽，307 u)进行校正。以标准蛋白分子质量对数(lgMr)为纵坐标，有效分配系数[Kaw=(Ve-V0)/(Vt-V0)]为横坐标绘制标准曲线，y=-3.734 7x+ 4.815 3(R2=0.982)。
将样品配成蛋白质质量浓度为2 mg/mL的溶液，经离心和0.22 μm微孔滤膜过滤后加载于色谱柱。上样体积100 μL，流速0.25 mL/min，检测波长214 nm。溶解样品及色谱柱的平衡和洗脱均采用pH 7.0、20 mmol/L的磷酸盐缓冲液(含有0.15 mol/L NaCl)。基于样品组分的洗脱体积(Ve)计算Kaw及样品组分的分子质量。
1.3.3 玉米糖肽体内营养质量的研究
1.3.3.1 大鼠氮代谢实验
采用Mensa-Wilmot的方法进行大鼠氮代谢实验[11]，略有修改。雌性SD大鼠40只(21日龄)，按体重随机分为5组：无氮组、玉米醇溶蛋白组、玉米肽组、玉米糖肽组和酪蛋白组。每个实验组8只大鼠，分别装进个体代谢笼内，饲喂基础饲料。饲养的方式采用自由饮食和饮水，饲养的环境条件为：温度18～26 ℃，相对湿度40%～70%，通风良好，无噪声，12 h光照/黑暗交替循环。
开始7 d为环境及饲料的适应期，每只投喂基础饲料量为15 g/d，2～3次/d。在第8 天清晨撤掉基础饲料和水，3 h后称量体重，开始投喂配方饲料，进入5 d的氮代谢实验。饲料配方参照Wong等[12]描述的化学成分，如表1所示。氮代谢期内，记录每天每只大鼠所消耗的饲料量，用于对饲料真消化率(TD)、表观消化率(AD)、净蛋白利用率(NPUR)和生物价(BV)的测定，计算公式为式(3)～式(6)。
表1 实验中大鼠饲料的化学成分
(3)
(4)
NPUR=
(5)
BV=[NPUR-(粪氮量-代谢氮)]×100
(6)
1.3.3.2 大鼠生长实验
在氮代谢实验中，每日称量大鼠体重，并准确记录每日的饲料添加量及每日实验结束时食槽内的余料量，计算各处理组实验动物的体重增加量和总摄食量。按照式(7)和式(8)计算蛋白质功效比值(PER)和净蛋白质比值(NPR)，按照式(9)计算校正PER，按照式(10)计算相对NPR。
(7)
(8)
(9)
(10)
1.3.4 数据统计分析
除氨基酸组成分析外，所有数据均以平均值±标准差表示，在大鼠氮代谢和生长实验中n=8，在蛋白质和肽含量以及体外消化实验中n=3。实验数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0进行单因素方差分析，采用LSD法进行组间多重比较，P<0.05为差异显著性水平。
2.1 玉米糖肽的基本营养组成
蛋白质含量与蛋白质提供氨基酸的能力直接相关，肽含量与蛋白质的消化率和生物利用度直接相关，两者均是评价食物中蛋白质营养质量高低的指标。以玉米肽为对照，测定玉米糖肽的蛋白质和肽含量，结果如表2所示。
表2 玉米糖肽和玉米肽的蛋白质和肽含量
由表2所示，与玉米肽相比，玉米糖肽的蛋白质含量降低，原因是玉米糖肽分子中共价结合的D-氨基葡萄糖使得单位质量玉米糖肽中蛋白质的含量相对降低，但质量相对增加。
玉米糖肽和玉米肽的肽质量分数均在75%以上，反映出玉米糖肽和玉米肽均具有较高的生物利用度，因为与大分子质量蛋白质相比，小肽不仅可以被动物胃肠道直接吸收，而且还具有促进免疫、抗氧化等生物活性[13]。
2.2 玉米糖肽的分子质量分布
采用凝胶色谱法测定玉米肽和玉米糖肽的分子质量分布，洗脱图谱如图1和图2所示。
图1 玉米肽的凝胶色谱洗脱图谱
图2 玉米糖肽的凝胶色谱洗脱图谱
由图1所示，玉米醇溶蛋白水解产物含有3个分子质量组分，分子质量主要分布在>6 390 u、6 390～300 u和<300 u范围内。其中，分子质量分布在300～6 390 u的组分为玉米肽的主要组分。与图1相比，图2所示的玉米糖肽洗脱图谱整体向左移动，说明TGase催化的D-氨基葡萄糖的共价结合和玉米肽分子间的交联反应使玉米肽的分子质量增加。玉米糖肽含有4个分子质量组分，分子质量主要分布在>6 500 u、6 500～4 259 u、4 259～427 u和<427 u 范围内。其中，分子质量>6 500 u肽段的含量是玉米肽的6.99倍，分子质量<427 u肽段的含量是玉米肽的5.48倍。一些研究表明，Alcalase同时具有枯草杆菌蛋白酶和谷氨酰胺内切蛋白酶活性，可以释放C末端具有Glu的肽段和疏水性补丁序列，导致生成的肽具有高聚集趋势[14,15]。在图1中，玉米肽中分子质量<300 u的小肽质量分数仅为4.1%，可能是因为小肽与大肽段发生了聚集。经D-氨基葡萄糖修饰后，<427 u组分含量增加，可能的原因是D-氨基葡萄糖的共价结合使玉米肽的疏水性降低，同时改善了玉米肽的电荷性质，使反应体系中静电排斥作用增强，阻碍了小分子质量玉米肽与大肽段的聚集，使小分子质量组分含量增加。
2.3 玉米糖肽的体外消化率
蛋白质的营养质量和营养状态可以根据蛋白质的消化率进行评估，因为消化率的变化可能是由于蛋白质质量方面的差异导致的。因此，可以用体外消化率表征玉米糖肽的营养质量，结果如表3所示。
表3 玉米糖肽和玉米肽的体外消化率
由表3所示，玉米糖肽及玉米肽的一步和二步体外消化率均大于87%以上，接近于或高于通常被认为是最易消化的蛋清蛋白(88.1%)[16]。玉米糖肽的一步消化率比玉米肽高6.18%，二步消化率比玉米肽高1.72%，说明与玉米肽相比，玉米糖肽更易于消化，可能是由于D-氨基葡萄糖的共价结合使玉米肽的溶解性相对增加所致。溶解度的增加可以使蛋白质具有更高的消化率[17]。含有更多Leu和具有更高总支链氨基酸含量的乳清蛋白比酪蛋白和大豆分离蛋白具有更高的体外消化率[18]。玉米糖肽中Leu和总支链氨基酸质量分数分别为15.51%和21.91%(数据未列出)，因此，玉米糖肽具有与牛乳清蛋白(97.0%)相似的生物利用度[19]，也可能与其氨基酸组成有关。
2.4 玉米糖肽在大鼠体内的营养特性
2.4.1 TD和AD
食物蛋白质的TD是反映蛋白质在消化道内被分解和吸收程度的一项指标。粪代谢量较低，如略去不记的话，则测定的结果为AD。实验中采用的4种配法饲料的TD和AD值如表4所示。
表4 4种配方饲料的TD和AD值
由表4可以看出，4种配方饲料对大鼠摄食氮量没有显著性影响(P>0.05)，说明添加4种待测原料后，大鼠日粮的适口性和可接受性没有受到影响，没有任何适口性介导的采食拒绝，不存在因摄食氮量不同而对氮代谢实验产生的负面影响。
4种原料的TD和AD值均大于97%以上，说明这4种原料均具有优异的消化性能，与动物蛋白如鸡蛋(98%)和胶原蛋白(95%)的TD值相当[20]。其中，玉米肽组的TD值显著高于玉米醇溶蛋白组(P<0.05)，且与酪蛋白组相当(P>0.05)，说明玉米肽比玉米醇溶蛋白更容易被大鼠消化吸收。与玉米肽组相比，玉米糖肽组的TD值略有下降，但差异不显著(P>0.05)。Tang等[21]研究了TGase催化的大豆分离蛋白交联反应，发现交联产物的胃蛋白酶消化率下降，但其营养价值和生物利用度与未经处理的蛋白相似。蛋白质的交联反应可以对蛋白质的营养特性产生负面影响，包括营养价值和消化率等[22]。玉米糖肽的TD值略低于玉米肽，可能是由于在玉米糖肽制备过程中，除了D-氨基葡萄糖的共价结合反应外，玉米肽肽链末端的游离-NH2可以与含有Gln残基的玉米肽分子发生少量交联反应，这部分交联产物会使玉米糖肽的消化率略有降低。
用4种配法饲料喂养时，大鼠每天的尿氮量间差异不显著，但粪氮量的组间变化较大。当饲料以酪蛋白作为唯一蛋白质来源时，大鼠的平均粪氮量低于其他配方饲料，表明酪蛋白具有较高的饮食氮保留率。用玉米醇溶蛋白作为唯一蛋白质来源时，大鼠的平均粪氮量高于其他3种配方饲料，表明玉米醇溶蛋白虽然具有较高的消化性能，但是其具有较低的饮食氮保留率，不利于大鼠的生长和发育。玉米糖肽和玉米肽的粪便氮量与酪蛋白组相比，无显著性差异，说明玉米糖肽与玉米肽具有与酪蛋白相似的蛋白质品质。
2.4.2 BV和NPUR
BV是衡量人体从饮食中吸收蛋白质效率的指标，一般情况下，营养质量良好的食物蛋白质的BV在70%～100%之间[23]。NPUR指未考虑在消化过程中没有吸收而丢失的氮，它将蛋白质BV值与消化率结合起来能更全面的反映蛋白质的品质。4种配法饲料的BV和NPUR的测定结果如表5所示。
由表5所示，4种配法饲料的BV值均在90%以上，说明实验中采用的4种原料均是营养质量良好的蛋白质，均可以用于蛋白质高效饮食的配制。其中，酪蛋白组的BV值最高，被机体的吸收利用率最高。与玉米醇溶蛋白相比，玉米肽和玉米糖肽组的BV值极显著增加(P<0.01)，但玉米糖肽与玉米肽的BV值之间无显著性差异(P>0.05)，说明酶法水解改善了玉米醇溶蛋白的机体利用率，而酶法糖基化修饰没有影响玉米肽的机体利用率，可能与玉米糖肽制备过程中玉米肽分子内发生的少量交联反应有关。
表5 4种配方饲料的BV和NPUR值
在NPUR方面，与玉米醇溶蛋白相比，玉米糖肽的NPUR值显著增加，且玉米糖肽的NPUR值与酪蛋白组相比差异不显著(P>0.05)，说明酶法水解与酶法糖基化修饰相结合的方式显著改善了玉米醇溶蛋白的营养品质，玉米糖肽可以被机体充分吸收利用。
2.4.3 大鼠体重增加量、PER和NPR
实验动物的体重、体长等指标的测量是鉴定蛋白质营养状况的重要依据。在配方饲料中，以10%的玉米糖肽作为唯一氮源，研究了玉米糖肽摄入对大鼠体重增加量的影响，并根据体重增加量和摄食氮含量计算了PER，而NPR是在PER的基础上加上无氮组体重减轻值计算出来的，结果见表6。
由表6可以看出，4种样品对实验动物体重增加量的影响具有显著性差异，表明这4种样品维持动物生长的能力不同。随着实验的进行，玉米醇溶蛋白组大鼠的体重逐渐下降；
玉米糖肽和玉米肽的摄入均使大鼠体重显著增加，说明玉米醇溶蛋白虽然在大鼠体内的消化率高，但氮的被吸收量及吸收蛋白质的被利用率低，而经酶法水解及酶法糖基化修饰后，玉米醇溶蛋白的营养质量显著改善。
表6 4种样品对大鼠体重增加量、PER和NPR的影响
在PER方面，酪蛋白组的PER值最高，蛋白质利用效率最好，促进了实验动物的生长发育。与玉米醇溶蛋白组相比，玉米肽组的PER显著增加，与玉米肽组相比，玉米糖肽组的PER显著提高。He等[24]评估了玉米肽与玉米蛋白粉的PER，发现玉米肽的PER值是玉米蛋白粉的1.72倍，即酶法水解提高了玉米蛋白的生物利用度，与本实验的结果一致。酪蛋白的标准PER值为2.5，PER值大于2.5的产品被认为是极好的蛋白质来源，玉米糖肽的校正PER为1.60，是玉米肽的1.70倍，说明玉米糖肽是一种良好的蛋白质来源，也说明糖基化修饰在一定程度上提高了玉米肽的营养品质。PER的差异与蛋白质的营养质量和含量有关[28]。在蛋白质含量相同的情况下，PER的差异主要与蛋白质的营养质量有关。虽然玉米醇溶蛋白的体内消化率较高，但氨基酸组成等因素导致其在机体内的利用程度及效率低，不能促进动物的生长发育；
与玉米肽相比，玉米糖肽具有更好的营养品质，即糖基化修饰使玉米肽的蛋白质量提高。
在NPR方面，与玉米醇溶蛋白相比，玉米糖肽和玉米肽的NPR值显著提高(P<0.05)，且玉米糖肽组的NPR值比玉米肽高25.83%，但两者间无显著性差异(P>0.05)。将酪蛋白的NPR校正为100，可以从NPR数据中计算出相对NPR。玉米糖肽的相对NPR是玉米肽的1.35倍，表明玉米糖肽在支持断奶大鼠的生长和营养维持方面比玉米肽更有效，即酶法糖基化修饰可以改善玉米肽的营养品质。
本研究主要通过体外模拟胃肠消化以及大鼠氮代谢和生长实验评价了玉米糖肽的营养特性。玉米糖肽的肽质量分数为78.31%；
TD和NPUR分别为(98.54±0.52)%和(95.01±1.61)%，与酪蛋白和玉米肽相比差异不显著；
PER和校正PER值分别为7.02和1.60，NPR和相对NPR分别为9.95和71.79，表明玉米糖肽具有促进动物发育的作用，是一种良好的蛋白质资源。今后可探索玉米糖肽的健康功效，开发玉米糖肽的产品。
