邢 巧，皮汶灵，冉志文，王 锴,，王怡涵，虞欢欢，刘青林，熊政委,,3,*
1.重庆第二师范学院 生物与化学工程学院 (重庆 400067)2. 重庆第二师范学院 脂质资源利用及儿童日化品研发重点实验室 (重庆 400067)3. 广西农产资源化学与生物技术重点实验室 (玉林 537000)
油橄榄是一种常绿矮小乔木油料作物，常被地中海沿岸国家作为油料作物种植，我国近年来在四川、云南、甘肃等地也有种植。油橄榄有巨大的自然社会和经济利用价值以及丰富的营养价值，果肉中含有大量人体所需的营养元素，其油脂中脂肪酸比例在各种天然油脂中较为合理。现在市售的橄榄油绝大部分使用新鲜果实进行物理压榨，即冷榨。通过此方法，尽可能保留较高的营养价值，其果渣中也含有大量活性物质。但是目前对此的研究不够深入，一直未被广泛的利用。
近年来，消费者越来越注重食品的健康，橄榄油也进入国人的视野。虽然我国橄榄油主要依靠国外进口，但国内也开始种植和发展自己的橄榄油品牌，例如渝江源、祥宇、剑门等品牌。随着橄榄油种植范围扩大，资源是否合理利用和环境污染问题也随之而来[1]，经研究发现橄榄果渣中含有丰富的酚类物质以及对人体有益的多种矿物质，其中酚类物质有一定的保健功效。目前需要将橄榄果渣中的活性物质利用起来，因此如何提高萃取和提纯的能力成为如今的研究目的。现在可以使用有机溶剂、半透膜以及大孔树脂等富集纯化方法，收集油橄榄果渣中的酚类化合物，同时获得食品加工过程所需的抗氧化剂等。通过对提取和富集橄榄果渣中酚类物质的相关研究进行总结，旨在为橄榄果渣中酚类物质的提取加工及在食品业或者护肤品中的应用提供思路，有利于推动食品工业进步和环境保护[2-3]。
1.1 橄榄果渣现状及其主要成分
油橄榄果渣中含有大量的多酚、萜类化合物、酯类化合物等多种活性成分。我国对油橄榄果渣的再利用率不高，只有一些用来增强农田肥力或饲养动物，因而对各类资源产生一定浪费。油橄榄加工废弃物中有未完全榨取的橄榄果渣油和油橄榄果渣，果渣中含有橄榄苦苷、羟基酪醇等多酚物质，难溶于水，易溶于有机溶剂[4]。
1.2 橄榄果渣多酚物质作用及其应用
多酚物质对人体作用以及机理，如表1所示。
表1 多酚对人体的作用以及对应作用机理
在日常饮食结构中经常食用含有油橄榄的食品或者橄榄饮料，会使X综合征患者饭后的相关反应明显减少。其中减少相关反应的主要成分为酚类物质，酚类对甲状腺、肿瘤及血糖等有一定调节功效[5-6]。橄榄果渣中的多酚物质是食品药品行业中功能性天然药物的宝贵来源，不仅可以用来制成食品加工所需的抗氧化剂以及清除自由基，满足各种保健功效的食品，还可以制成肥料改善土壤[7-8]。
2.1 橄榄果渣样品的制备
从工厂中得到榨油后的橄榄果渣，试样可放置于-20 ℃的环境中长期进行贮藏存放，并取出样品置于冷冻干燥机中进行烘干。首先利用有机溶剂正己烷预处理，清除果渣中未充分提炼油脂，然后利用减压回收有机溶剂，得到预处理橄榄果渣。预处理后的橄榄残渣置于通风橱中干燥、捣碎、筛分后，作为橄榄多酚提取物的主要原料。
2.2 固液萃取
固液萃取利用溶剂使被萃取物质中的可溶性成分溶解达到分离的目的，可溶性成分依据其极性分子大小的差异分散在不同极性的液相中，利用相似相溶原理分离后再进行物理分离。由于醇水体系对目标化合物的选择性较高，因此醇水体系是提取多酚化合物常用的溶剂[9]。固液萃取流程示意见图1。
醇水体系中目前有乙醇提取法、甲醇提取法等。新鲜果渣前处理后，用乙醇溶液在0 ℃～4 ℃下低温萃取，其中乙醇浓度为80%[10]。在一定温度内，固液萃取的效率会随着温度的升高而提高，由于多酚化合物不耐热、易氧化的特性，随着温度的上升氧化反应会更加的剧烈使其含量不断下降，因此在提高得率的前提下相对低温萃取保证了多酚的生物活性[11]。在提取多酚化合物的同时也要注意浸提的时间，使用的高浓度乙醇会破坏目标物质中的化学键，恰当的时间会减少多酚物质被溶剂的破坏因而可以得到更多的目标产物。正己烷、丙酮都有一定毒性会对人体造成一定危害通过对比得出结论乙醇溶液能更好的提取目标产物，但是在实际运用过程中不仅采用了简单的固液萃取，而且在一定温度范围内利用高温高压的方法辅助提取，达到提高浸提率的目的[12-13]。
图1 固液萃取流程图
2.3 水解作用
在王志宏[14]的研究中，在醇水体系的固液萃取不能完全对酚类化合物进行提取，是由于酚类化合物中存在大量的酯键和糖苷键。为获得更多目标产物，目前通常使用非物理方式破坏这系列化学键在温度一定下有酸解、碱解以及酶解等方法以达到提高产率的目的。水解后与未被水解的样品中的酚类物质相比会破坏一部分生物活性成分，未水解的酚类提取物中羟基酪醇、酪醇等一系列化合物的含量较高，因此经过化学处理会减弱生物活性。
通过盐酸水解提取橄榄果渣中的羟基酪醇，王强等人在88 ℃下水解86 min、其中为料液比(g/mL)1∶36，盐酸浓度1.2 mol/L，利用响应面优化工艺后橄榄果渣中羟基酪醇的提取量为(3.38±0.12) mg/g[15]。酶解法中水解酶有β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶等，其水解能力最强的为β-葡萄糖苷酶，其中酶解效果最差的为碱性蛋白酶[16]。原姣姣对橄榄苦苷提取物使用专一性好的半纤维素酶进行酶解，并且采用高速逆流色谱联用技术与大孔吸附树脂分离得到85.7%高纯度羟基酪醇[17]。水解法中盐酸水解优于酶水解，其中使用酸解方法具有操作简便、高效、低耗能、低成本等优点，适于大规模投入使用；
酶解法具有反应过程相对温和的优点，但其污染物的排放不符合生产生活的要求。
2.4 超声波-微波辅助提取
超声波辅助提取法利用超声波在一定频率条件下会产生负压，提取介质物理化学性质发生变化形成空穴破坏细胞壁，使得溶剂在细胞中加速扩散提高了酚类物质的提取率。超声辅助提取通常使用超声棒或超声池，此方法简单快速且只需要在常温下进行，非常适合活性化合物的提取。将甲醇和乙酸乙酯溶剂固液萃取和超声波辅助法提取效果相比，超声波辅助提取效率更高[18-21]。
何志勇等[22]通过实验得到在80 W超声波功率条件下,超声提取25 min时橄榄多酚的提取率最高。参照林玉芳的超声辅助法,精确称量橄榄粉末，加入石油醚(沸程30 ℃～60 ℃)脱脂、去除色素，然后在常温中加入料液比(g/mL)为1∶30，浓度为40%乙醇并搅拌均匀，超声功率为300 W连续处理20 min，提取2次上清液，合并2次提取液连同残渣倒入离心管，常温条件下10 000 r/min离心10 min，上清液即为提取液[23]。橄榄苦苷的提取方法是用超声波辅助提取并在线动态检测橄榄苦苷的含量，其提取效果高于溶剂提取。固液萃取加热回流提取是利用微波提取植物多酚常采用的方法，其提取效率相对较低、耗时长、能耗较高。超声辅助提取法的优点是油橄榄果渣多酚的提取量与常规溶剂提取方法相比提高了18%～38%，微波萃取极大的改善其固液萃取的缺点，提高效率有效降低耗能[24]。
2.5 超临界CO2提取
多酚类化合物常为极性化合物，在超临界提取过程中通常需加入一些极性溶剂，例如甲醇或乙醇等[25]。党建章等利用超临界CO2流体从橄榄叶中萃取橄榄苦苷，其提取得率达到0.245 mg/g。超临界CO2在有机溶剂的辅助下，提取的酚类物质比起固液萃取的酚类物质含量更高。不仅解决了固液萃取和微波辅助提取有机溶剂消耗大，回收溶剂困难的实验安全隐患，还解决了因高温条件下，多酚物质分解而引起提取率下降的难题。
3.1 橄榄果渣多酚物质的富集与分离纯化
大孔吸附树脂是利用物理原理有选择的吸附溶液中物质，吸附过程中不发生化学变化，样品仅根据分子间的作用力和氢键达到分离纯化和富集的目的。大孔吸附树脂因其操作方式简便，目标产物能够很好地分离，所得样品纯度高，因此如今在世界上广泛用于富集和分离纯化。大孔吸附树脂富集分离流程示意见图2。
图2 大孔吸附树脂富集分离流程图
利用大孔树脂进行富集纯化，首先需要判断样品极性来选择对应型号的树脂，其次用95%的乙醇溶液进行预处理，然后对树脂进行筛选，最终完成洗脱和富集。橄榄多酚富集效果和损失率受树脂型号、洗脱液、洗脱时间、pH值等影响。树脂分离纯化橄榄中的多酚活性物质洗脱效率较高，其吸附率均在85%以上，解析率和纯度比例都比较高，多酚物质得到很好的富集与纯化[26]。其中作为富集纯化橄榄中的多酚物质洗脱剂最好使用廉价易得、安全无毒的乙醇作为解析剂。因为提取的橄榄多酚多用于食品级或医药行业，所以选用对人体危害最小乙醇解析剂。
许伟[27]创新使用碳纳米管新型材料富集橄榄多酚，由于碳纳米管具有 强度高、耐酸碱、化学性质稳定等优势，被广泛应用于分离科学领域，其中包括分离纯化橄榄多酚。橄榄多酚在乙腈、乙醚等为洗脱剂的碳纳米管中洗脱效率均在78.43%～95.77%，甲醇的吸附率在83.42%～95.93%，其效率与大孔树脂吸附相比吸附率较高但使用率较低。其一是因为碳纳米管本身对人体会产生一定的危害且也会导致水生生物生长缓慢甚至死亡；
其二是碳纳米管作为新型超导材料制作工艺条件的严苛导致其价格昂贵，与具有同样作用的大孔吸附树脂相比价格相差甚远。因此碳纳米管分离纯化多酚物质常用于实验室方法，由于成本过高不适用于工厂大规模使用。
3.2 橄榄果渣酚类物质含量测定方法
高锰酸钾氧化法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、原子吸收光谱法等都为目前测定多酚含量比较常用的方法[28]。油橄榄果渣中多酚含量测定最为常用的方法是分光光度法，其中福林酚法最为常用。Folin-Cilcalteu比色法的工作原理是通过配制的一系列浓度梯度标准溶液绘制一条标准浓度曲线，再利用分光光度计测样品的吸光度，样品吸光利用标准浓度曲线得到样品多酚的含量。福林酚和NaCO2的用量以及间隔、反应和作用时间等因素都会影响测定油橄榄果渣中多酚物质的含量，其中福林酚-标准曲线法与酒石酸亚铁-换算系数法和酒石酸亚铁标准曲线法中测得多酚含量相对比较低。
橄榄果渣中含有大量对人体有益的活性物质，但目前市场上橄榄果渣利用率不高。从橄榄果渣中有效提取其中的酚类物质，我们可以利用固液萃取、水解作用、超声波辅助提取等方法。其中利用超声波辅助提取法操作更便捷、残留量少且提取率较高，是目前使用最为广泛的提取方法。酚类物质提取后选择适宜的大孔树脂对其进行纯化与富集，最终利用分光光度法利用没食子酸标准曲线来测定提取物中多酚的含量。
现在通过确定橄榄果渣中主要活性物质，以及提取其中的活性物质的研究，丰富了橄榄果渣中提取酚类物质的理论，为提高橄榄果渣多酚活性物质奠定了基础。但是在橄榄果渣活性物提取的研究中，如何明确提取酚类物质的实验方法，以及将酚类物质进行精练纯化和能否单独在橄榄果渣中提取一种目标物质，是橄榄果渣活性物质研究中遇到的新课题，今后有待进一步研究。
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