卢飞， 吴宇鹏， 姚女兆
(南华大学衡阳医学院附属第一医院脊柱外科，湖南省衡阳市 421001)
腰椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起腰腿疼痛的主要原因，但具体机制尚不明确[1]。高迁移率族蛋白2(high mobility group box 2，HMGB2)和淋巴样增强因子-1(lymphoid enhancer-binding factor 1,LEF1)能够共同作用增强Wnt信号通路，并促进软骨细胞的生物学过程。当HMGB2和LEF-1之间的相互作用下降甚至消失，则可导致软骨退行性改变。椎间盘髓核细胞为类软骨细胞，软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱ collagen，Col Ⅱ)降低可能是软骨细胞退行性改变的分子作用机制之一[2]。本文探讨HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ在退变腰椎间盘髓核组织中的表达及其相关性，现报道如下。
1.1 一般资料
收集2020年7月1日—12月31日就诊于本院脊柱外科17～69岁患者20例手术标本(标准后路腰椎手术或椎间孔镜手术获取相对完整髓核新鲜组织)，存放于-80 ℃超低温冰柜。术前患者已知情同意且签署知情同意书。采用Pfirrmann分级方法对患者椎间盘退变程度进行分级，Ⅱ级、Ⅲ级为轻度退变组，Ⅳ、Ⅴ级为重度退变组。纳入轻度及重度退变组标本各10例。此次研究已获得本院伦理委员会批准。排除病例：①严重心、肝、肾等器质性疾病；
②严重腰椎感染性疾病；
③类风湿疾病；
④脊柱原发性或转移性肿瘤；
⑤慢性糖尿病；
⑥系统性红斑狼疮等全身免疫系统疾病；
⑦两次或多次脊柱或腰椎手术患者；
⑧信息资料不全。
1.2 qRT-PCR实验
采用TRIzol法提取总RNA。HMGB2引物序列上游5′-AGTCAGCCAAAGATAAACAACCA-3′，下游5′-TCCTGCTTCACTTTTGCCCTT-3′;LEF-1引物序列上游5′-AGAACACCCCGATGACGGA-3′，下游5′-GGCATCATTATGTACCCGGAAT-3′;Col Ⅱ引物序列上游5′-GCGGTAGAGACCCGGACC-3′，下游5′-TCCGGCTTCCACACATCCTTA-3′。根据TRIzol试剂说明书提取髓核组织总RNA。按试剂盒说明书选择RT试剂盒进行反转录后，再完成PCR检测，所有反应的产物均应用Melt曲线进行分析，采用ΔΔCt方法检测其相对表达量。实验均重复3次。
1.3 Western boltting检测
髓核细胞3 000 r/min离心10 min，4 ℃离心弃上清，用PBS先后冲洗3次去掉废液，沉淀后加入蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液，冰上裂解30 min。将裂解后的细胞悬液置于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，获取的上清液即为蛋白提取液，将其转移到EP管，加入loading buffer在95 ℃煮10 min。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳后进行转膜，将其转至0.45 μm PVDF膜上，随后将转好的PVDF膜放至5%牛奶中封闭4 h，4 ℃孵育HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ和内参β-actin一抗过夜，完成一抗孵育后，用TBST缓冲液漂洗3次,每次15 min。再孵育2～4 h二抗，同样用TBST缓冲液漂洗3次，每次15 min。显影剂显影后拍照。
1.4 统计学处理
2.1 各组HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA及蛋白水平的比较
与轻度退变组比较，重度退变组HMGB2、Col Ⅱ mRNA降低(P<0.05)；
LEF-1 mRNA升高(P<0.05；
表1)。与轻度退变组比较，重度退变组HMGB2蛋白表达降低(P<0.05；
表2和图1)。
表1 不同退变程度腰椎髓核组织HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA水平的比较
表2 不同退变程度腰椎髓核组织HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ蛋白水平的比较
图1 Western blotting检测结果
2.2 HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA水平的相关性分析
Pearson分析结果显示，HMGB2 mRNA水平与Col Ⅱ mRNA水平呈正相关，与LEF-1 mRNA水平呈负相关；
LEF-1 mRNA水平与Col Ⅱ mRNA水平呈负相关(P<0.05；
表3)。
表3 腰椎间盘髓核组织中HMGB2、LEF-1、Col Ⅱ mRNA表达水平的相关性
HMGB2参与体内DNA修复、基因转录调控、细胞增殖、细胞转移等过程[3]。关节软骨的浅表区可以产生润滑素[4-5]，而润滑素是一种重要的关节润滑剂[6-7]。研究发现，人类患骨关节炎可致软骨中HMGB2的表达水平降低或消失[8]。润滑素的空间分布与HMGB2相似，并参与软骨和关节内稳态[9]。由于滑膜中HMGB2表达的减少与润滑素在关节软骨浅表区的表达缺失无相关性，提示HMGB2在连接软骨浅表区细胞中具有独特的作用[10]。因椎间盘髓核细胞与关节软骨细胞具有高度同源性，故推测椎间盘髓核细胞中HMGB2可能具有类似关节软骨中HMGB2相似功能。本文重度退变组HMGB2表达较轻度退变组降低(P<0.05)，提示HMGB2可能为IDD发生和病情进展的预测性指标。
LEF-1主要通过HMG结合域[11]和β-catenin结合域[12-13]发挥作用，与细胞的分化、肿瘤的发生有关。HMGB2增强了LEF-1与其靶序列的结合，促进了LEF-1-β-catenin复合物的转录激活。研究表明，Wnt/β-catenin的激活可以促进髓核母细胞的增殖，触发细胞衰老的发生，从而诱导IDD发生和病情的加重[14]。LEF-1在体外实验和体内实验都影响着成骨细胞的增殖、成熟和再生[13]。本文重度退变组LEF-1相对表达较轻度退变组升高，提示LEF-1的表达水平与髓核退变程度有关，临床上早期评估IDD患者疾病进展和病情严重程度可考虑利用LEF-1作为候选指标，通过检测其表达量判断IDD的发生与发展。
以上研究表明HMGB2和LEF-1可能在Wnt/β-catenin信号通路中也发挥发着重要作用，但具体机制有待进一步研究。
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