马光群,张胜男,梁伦海,柴晓云,赵风兰,孟庆国
(1. 烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,山东 烟台, 264005; 2.海军军医大学药学院,上海,200433)
近年来,深部真菌感染在免疫低下人群中的发病率和死亡率明显上升,已成为恶性肿瘤、器官移植等致死的直接原因[1-2]。临床上抗真菌药物比较少,主要有四类,即唑类(如氟康唑、伊曲康唑等)、多烯类(如两性霉素B)、核苷类似物(如5-氟胞嘧啶)和棘球菌素类(如卡泊芬净)[3]。三氮唑类药物是重要的抗真菌药物之一,它作为羊毛甾醇14-α去甲基酶(由ERG11基因编码)的抑制剂,能干扰麦角甾醇的产生[3-4],从而起到抗真菌的效果，但也面临着耐药性和抗菌谱窄等尴尬局面。因此设计合成高效、低毒、抗菌谱广的新型三氮唑类化合物成为研究抗真菌药物的热点[5-8]。
本研究根据三氮唑类药物的作用机制和构效关系,以及本课题组前期的研究工作[9-13],以伊曲康唑(图1)为先导化合物,目标化合物保留基本药效团三唑环,1,3-二氧戊环和 2,4-二氯苯基。顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基甲磺酸酯(1)经过叠氮反应和还原反应生成中间体3。2-苄氧基乙醇经亲核取代反应和水解反应生成4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸。中间体3再与4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸经缩合反应,还原反应和亲核取代反应生成关键中间体10。最后中间体10与各种胺发生亲核取代反应,在侧链引入苯甲酰胺,以期找到活性更好的抗真菌化合物。
1.1 实验仪器
PL 203电子天平(博特勒-托利多仪器有限公司);循环水式多用真空泵ZF78(上海豫康科教仪器设备有限公司);R-3旋转蒸发仪(瑞士BUCHI有限公司);C-MAG HS7型恒温磁力搅拌器(德国IKA公司); DLSB系列低温冷却循环泵(上海豫康科教仪器设备有限公司);SHB-ⅢA三用紫外分析仪(上海豫康科教仪器设备有限公司);MB SPS-800有机溶剂净化系统,核磁共振谱使用Broker Spectrospin AC-P 300MHz/Agilent 600 MHz型核磁共振仪(安捷伦科技有限公司)进行测定,CDC13/CH3OD为溶剂,TMS为内标。
1.2 实验材料和试剂
所有试剂均为市售分析纯或化学纯,薄层层析硅胶板为烟台江友公司生产,300-400目柱层析硅胶为青岛海洋化工厂生产。
1.3 合成路线
本研究共设计合成了13个未见文献报道的化合物,合成路线及目标化合物结构如图2所示。
试剂和反应条件: (a) NaN3, DMF, 100～200 ℃, 10 h; (b) Pd/C, H2, CH3OH, 12 h; (c) TsCl, Py, DCM, 0 ℃-rt, 24 h; (d) 4-羟基苯甲酸乙酯, Cs2CO3, DMF, rt, 12 h; (e) NaOH, 二氧六环/H2O(5:1), 回流, 4h; (f) 中间体7, EDCI, DMAP, DCM, 回流, 4 h; (g) Pd/C, H2, Cs2CO3, CH3OH, rt, 10 h; (h) TsCl, TEA, DCM, 0 ℃-rt, 30 h; (i) 胺, Cs2CO3, TBAI, DMF, rt, 48 h。
1.4 合成步骤
1.4.1 顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]叠氮甲烷(2)的制备 将顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基甲磺酸酯 (10.00 g, 25 mmol) 加入 250 mL 茄形瓶中,加入50 mL N,N-二甲基甲酰胺搅拌使之溶解。随后再加入叠氮钠 (8.00 g, 125 mmol),在100～120 ℃下反应 10 h。
TLC 监测至反应完全,停止反应。反应液中加入100 mL 水,用二氯甲烷萃取三次,有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩溶剂,得浅黄色油状物顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]叠氮甲烷 8.85 g,收率96.7%。
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.22 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.47～7.52 (m, 2H),7.24 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 1H), 4.81 (d,J=15.0 Hz, 2H), 4.14～4.21 (m, 1H), 3.87 (dd, 6.0, 9.0 Hz, 1H), 3.65 (dd,J=6.0, 9.0 Hz, 1H), 3.16 (dd,J=6.0, 15.0 Hz, 1H), 3.08 (dd,J=6.0, 15.0 Hz, 1H)。
ESI-MS (m/z): [M+H]+355.14。
1.4.2 顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲胺 (3)的制备 取 250 mL 茄形瓶,加入顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]叠氮甲烷(8.85 g, 25 mmol),加入100 mL 甲醇,搅拌使之溶解。将钯碳 (10%, 250 mg)加入反应液,连接氢气袋,室温下搅拌,反应 12 h,TLC 监测反应至原料消失,停止反应。过滤,浓缩溶剂得淡黄色粉末顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲胺7.32 g, 收率89.1%。
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.21 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.58 (d,J=6.0Hz, 1H), 7.47 (d,J=2.4 Hz, 1H), 7.24～7.27 (m, 1H), 4.78 (d,J=15.0 Hz, 2H), 3.99～4.07(m, 1H), 3.85 (t,J=6.0 Hz, 1H), 3.52 (dd,J=6.0, 12.0 Hz, 1H), 2.68 (dd,J=3.0, 12.0 Hz,1H), 2.48 (dd,J=6.0, 12.0 Hz, 1H)。
ESI-MS (m/z): [M+H]+329.07。
1.4.3 2-苄氧基乙基对甲苯磺酸酯(5)的制备 取2-苄氧基乙醇(10.00 g, 66 mmol)、100 mL无水二氯甲烷加入到 500 mL 茄形瓶中使之溶解, 再加入吡啶 (16 mL, 198 mmol) 加入反应液, 冰浴 15 min。随后称取对甲苯磺酰氯 (15.10 g, 80 mmol), 溶于100 mL 二氯甲烷中,用恒压滴液漏斗缓慢滴入反应液。滴加完毕后移至室温反应 24 h。
TLC 监测至反应完全,依次用1 mol/L 盐酸,饱和氯化钠溶液洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥。浓缩溶剂,经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯),得无色油状物 2-苄氧基乙基对甲苯磺酸酯16.80 g,收率84.1%。
1.4.4 4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸乙酯 (6)的制备 取2-苄氧基乙基对甲苯磺酸酯(2.00 g, 6.5 mmol) 和对羟基苯甲酸乙酯(1.09 g, 6.5 mmol) 加入 100 mL 茄形瓶中, 加入30 mL无水N,N-二甲基甲酰胺,搅拌使之溶解,再加入碳酸铯 (8.50 g, 26 mmol),室温搅拌反应 12 h, TLC监测至反应完全。反应液中加入 40 mL 水,用乙酸乙酯萃取,有机相用无水硫酸钠干燥。经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯),得淡黄色油状物 4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸乙酯1.65 g,收率85.3%。
1.4.5 4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸 (7)的制备 取4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸乙酯(1.65 g, 5.5 mmol)和40 mL 1,4-二氧六环加入到 100 mL 茄形瓶中,搅拌使之溶解,缓慢滴加 5 mL 6 mol/L NaOH水溶液,滴加完毕后加热回流反应 4 h, TLC 监测至反应完全,停止反应。随后用1 mol/L HCl 调节pH至3～4,用二氯甲烷萃取,有机相无水硫酸钠干燥。浓缩溶剂,得白色固体4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸1.36 g, 收率91.1%。
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.10 (d,J=8.9 Hz, 2H), 7.30～7.46 (m, 5H), 7.00 (d,J=8.9 Hz, 2H), 4.68 (s, 2H), 4.16～4.34 (m, 2H), 3.80～3.96 (m, 2H)。
1.4.6 顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-苄氧基乙氧基)]苯甲酰胺 (8)的制备 取100 mL 茄形瓶,加入顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲胺(5.00 g, 15.3 mmol)和100 mL二氯甲烷,搅拌使之溶解。然后加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (7.30 g, 38.2 mmol)和4-二甲氨基吡啶 (400 mg, 3.27mg),室温搅拌 1 h。最后加入4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸(5.00 mg, 18.4 mmol),加热回流反应 4 h, TLC 监测反应原料消失,停止反应。随后依次用 1 mol/L HCl 和水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥。经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯),得白色泡沫状固体顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-苄氧基乙氧基)]苯甲酰胺6.58 g,收率74.6%。
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.19 (s, 1H), 7.80 (t,J=8.4 Hz, 2H), 7.71 (s, 1H), 7.60 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.49 (d,J=2.1 Hz, 1H), 7.30～7.40 (m, 5H), 7.02 (d,J=8.4 Hz, 2H), 6.77 (t,J=6.0 Hz, 1H), 4.73～4.84 (m, 2H), 4.67 (s, 1H), 4.22～4.29 (m, 3H), 3.85～3.90 (m, 3H), 3.60～3.67 (m, 1H), 3.50 (dd,J=6.0, 9.0 Hz, 1H), 3.10～3.19 (m, 1H). ESI-MS (m/z): [M+H]+583.18。
1.4.7 顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-羟基乙氧基)]苯甲酰胺 (9)的制备 取250 mL 茄形瓶,加入顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-苄氧基乙氧基)]苯甲酰胺(5.83 g, 10 mmol)和100 mL甲醇,搅拌使之溶解,称取钯碳 (10%, 300 mg),连接氢气袋,室温搅拌 10 h, TLC 监测至反应完全,停止反应。浓缩溶剂,得淡黄色泡沫状固体顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-羟基乙氧基)]苯甲酰胺4.78 g,收率97.2%。
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.27 (s, 1H), 7.74～7.83 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 7.61 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.35 (d,J=6.0 Hz, 2H), 6.98 (s, 1H), 6.70 (t,J=6.0 Hz, 1H), 4.82～4.88 (m, 2H), 4.39～4.43(m, 2H), 4.24～4.27 (m, 3H), 3.85 (m, 1H), 3.60～3.67 (m, 1H), 3.47～3.52 (m, 1H), 3.14～3.22 (m, 1H)。
ESI-MS (m/z): [M+H]+493.11。
1.4.8 顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-甲苯磺酸酯乙氧基)]苯甲酰胺 (10)的制备 将顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-羟基乙氧基)]苯甲酰胺(4.92 g, 10 mmol)和二氯甲烷 100 mL 加入到250 mL 茄形瓶中,搅拌使之溶解,再加入无水三乙胺 (2.8 mL, 20 mmol),冰浴 20 min。将对甲苯磺酰氯 (2.86 g, 15 mmol),溶于50 mL二氯甲烷中,随后用恒压滴液漏斗将其缓慢滴入反应液中。滴加完毕后,撤去冰浴,室温搅拌 30 h, TLC监测至反应完全,停止反应。反应液依次用 1 mol/L 盐酸溶液、水和饱和氯化钠洗涤,有机相无水硫酸钠干燥。经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯),得白色泡沫状固体顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-对甲苯磺酸酯乙氧基)]苯甲酰胺4.20 g,收率65.5%。
1H NMR (300 MHz, CDCl3):δH 8.33 (s, 1H),7.78～7.87 (m, 4H), 7.72 (s, 1H), 7.60 (d,J=8.4 Hz, 1H), 7.50 (d,J=2.1 Hz, 1H), 7.39 (d,J=6.0 Hz, 2H), 6.91 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.73 (t,J=6.0 Hz, 1H), 4.80～4.86 (m, 2H),4.42～4.45 (m, 2H), 4.23～4.26 (m, 3H), 3.88 (m, 1H), 3.61～3.69 (m, 1H), 3.49～3.54 (m, 1H), 3.11～3.20 (m, 1H), 2.49 (s, 3H)。
ESI-MS (m/z): [M+H]+647.16。
1.4.9 顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-甲氨基乙氧基)]苯甲酰胺 (A1)的制备 取顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-对甲苯磺酸酯乙氧基)]苯甲酰胺(300 mg, 0.46 mmol) 于 50 mL 茄形瓶中,加入5 mL N,N-二甲基甲酰胺,搅拌使之溶解,加入甲胺 0.56 mmol,四丁基碘化铵 15 mg,碳酸铯 (605 mg,1.86 mmol),室温搅拌反应 48 h, TLC 监测至反应完全,停止反应。反应液中加入 20 mL 水,用二氯甲烷萃取三次,有机相用无水硫酸钠干燥。经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯),得白色粉末状固体A1。
收率61.1%; mp 155.3～156.4℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.16～8.18 (m, 1H), 7.78～7.81 (m, 2H), 7.60～7.67 (m, 1H), 7.28～7.46 (m, 2H), 6.95 (d,J=6.0 Hz, 2H),4.43～4.80 (m, 2H), 4.31 (t,J=6.0 Hz, 2H), 4.20～4.26 (m, 1H), 3.85～3.89 (m, 1H), 3.44～3.59 (m, 2H), 3.05～3.13 (m, 3H), 2.98 (s, 3H); ESI-MS (m/z): [M+H]+506.20。
化合物A2—A13制备方法同上,A2—A13的外观、收率、熔点、1H NMR和ESI-MS数据如下:
A2: 白色粉末状固体; 收率65.3%; mp 155.1～156.0 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.16～8.19 (m, 1H), 7.76～7.80 (m, 2H), 7.62-7.69 (m, 1H), 7.26～7.43 (m, 2H), 6.96 (d,J=6.0 Hz, 2H),4.42～4.79 (m, 2H), 4.33 (t,J=6.0 Hz, 2H), 4.25～4.28 (m, 1H), 3.85～3.88 (m, 1H), 3.45～3.60 (m, 2H), 3.04～3.14 (m, 3H), 2.95 (s, 6H); ESI-MS (m/z): [M+H]+520.19。
A3: 白色粉末状固体; 收率63.1%; mp 156.3～157.5 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.15～8.18 (m, 1H), 7.77～7.80 (m, 2H), 7.62～7.68 (m, 1H), 7.27～7.45 (m, 2H), 6.96 (d,J=6.0 Hz, 2H),4.45～4.82 (m, 2H), 4.30 (t,J=6.0 Hz, 2H), 4.22～4.26 (m, 1H), 3.83～3.87 (m, 1H),3.47～3.61 (m, 2H), 3.09～3.18 (m, 3H), 2.90 (q, 4H), 1.23 (t,J=6.0 Hz, 6H);ESI-MS (m/z): [M+H]+548.21。
A4: 白色粉末状固体; 收率65.5%; mp 156.5～157.7 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.23～8.27 (m, 1H), 7.81～7.84 (m, 2H), 7.69～7.74 (m, 1H), 7.49～7.50 (m, 1H), 7.38～7.44 (m, 2H), 6.95 (d,J=6.0 Hz, 1H), 4.78～4.81 (m, 1H), 4.51 (dd,J=6.0, 15.0 Hz, 1H), 4.25～4.28 (m, 1H),4.19～4.21 (m, 2H), 3.83～3.87 (m, 1H), 3.52～3.57 (m, 2H), 3.20～3.24 (m, 1H), 3.03 (s, 2H),2.62 (t,J=3.0 Hz, 4H), 1.57～1.61 (m, 4H), 0.91～0.94 (t,J=3.0 Hz, 6H);ESI-MS (m/z): [M+H]+576.27。
A5: 白色粉末状固体; 收率72.2%; mp 156.2～157.6 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.15 (s, 1H), 7.76～7.77(m, 2H), 7.65 (d,J=6.0 Hz, 1H), 7.33～7.43 (m, 2H), 7.20～7.24 (m, 1H), 6.94 (d,J=6.0Hz, 1H), 4.72～7.77 (m, 1H), 4.42～4.52 (m, 1H), 4.20～4.22 (m, 1H), 4.21 (t,J=6.0 Hz, 2H),3.79～3.83 (m, 1H), 3.45～3.57 (m, 3H), 2.74～2.76 (m, 4H), 1.84～1.86 (m, 4H);ESI-MS (m/z): [M+H]+546.20。
A6: 白色粉末状固体; 收率75.3%; mp 155.8～157.1 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.15 (d,J=3.0 Hz, 1H),7.76～7.79 (m, 2H), 7.70 (s, 1H), 7.50～7.52 (m, 1H), 7.33～7.45 (m, 2H),6.98 (s, 1H), 6.96 (s,1H), 4.77～4.83 (m, 1H), 4.44～4.56 (m, 1H), 4.22～4.27 (m, 1H), 4.17 (t,J=6.0 Hz, 2H),3.83～3.87 (m, 1H), 3.59～3.64 (m, 1H), 3.46～3.53 (m, 1H), 3.06～3.17 (m, 1H), 2.81～2.83 (t,J=6.0 Hz, 2H), 2.55 (br, 4H), 1.61～1.65 (m, 4H), 1.44～1.48 (m, 2H); ESI-MS (m/z): [M+H]+560.23。
A7: 白色粉末状固体; 收率73.1%; mp 156.3～157.5 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.16 (s, 1H), 7.69～7.82 (m, 3H), 7.28～7.53 (m, 3H), 6.99 (d,J=6.0 Hz, 1H), 4.76～4.84 (m, 2H), 4.44～4.48 (m, 2H), 4.24～4.28 (m, 1H), 3.85～3.89 (m, 1H), 3.62～3.66 (m, 1H), 3.48～3.55 (m, 1H), 3.33 (br, 1H), 3.11～3.18 (m, 3H), 2.53 (br, 2H), 1.78～1.80 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.53～1.55 (m, 1H), 1.00 (d,J=6.0 Hz, 1H); ESI-MS (m/z): [M+H]+574.26。
A8: 白色粉末状固体; 收率68.5%; mp 156.8～158.0 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.16 (d,J=3.0 Hz, 1H), 7.76 (m, 2H), 7.66～7.71 (m, 1H), 7.21～7.27 (m, 1H), 6.92～7.02 (m, 3H), 4.43～4.80 (m, 2H), 4.12 (br, 3H), 3.82～3.84 (m, 1H), 3.74 (br, 1H), 3.45～3.53 (m, 2H), 3.07～3.15 (m, 1H), 2.90～2.96 (m, 4H), 2.44 (s, 2H), 1.93 (br, 2H), 1.65 (m, 2H).; ESI-MS (m/z): [M+H]+576.35。
A9: 白色粉末状固体; 收率71.5%; mp 156.5～157.8 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.14 (d,J=3.0 Hz, 1H), 7.66 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 2H), 7.66 (d,J=3.0 Hz, 1H), 7.40～7.43 (m, 1H), 7.29～7.37 (m, 1H), 7.20～7.24 (m, 1H), 6.93 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 2H), 4.70～4.80 (m, 2H), 4.19～4.23 (m, 1H), 4.14 (t,J=6.0 Hz, 2H), 3.80～3.84 (m, 1H), 3.54～3.60 (m, 1H), 3.45 (dd,J=6.0, 12.0 Hz, 3H), 3.10～3.14 (m, 1H), 2.80 (t,J=6.0 Hz, 4H), 2.09～2.13 (m, 2H), 1.59～1.64 (m, 1H), 1.46～1.52 (m, 1H), 1.36～1.43 (m, 1H), 1.28～1.31 (m, 2H); ESI-MS (m/z): [M+H]+590.37。
A10: 白色粉末状固体; 收率66.2%; mp 156.3～157.9 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.14 (d,J=2.1 Hz, 1H), 7.73～7.76 (m, 2H), 7.64～7.69 (m, 1H), 7.44～7.51 (m, 1H), 7.19～7.23 (m, 1H), 7.00 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 1H), 6.90 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 2H), 4.68～4.78 (m, 2H), 4.17～4.22 (m, 1H), 4.13～4.15 (m, 2H), 3.78～3.82 (m, 1H), 3.63 (t,J=6.0 Hz, 2H), 3.49～3.56 (m, 1H), 3.42～3.48 (m, 1H), 3.09～3.13 (m, 1H), 2.96～3.05 (m, 4H), 2.81 (t,J=3.0 Hz, 2H), 1.44～1.49 (m, 3H), 1.28～1.33 (m, 4H); ESI-MS (m/z): [M+H]+604.44。
A11: 白色粉末状固体; 收率72.3%; mp 156.6～157.7 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.17 (s, 1H), 7.78～7.80 (m, 2H), 7.51～7.67 (m, 2H), 7.43～7.46 (m, 1H), 6.99 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.71～6.81 (m, 1H), 4.43～4.85 (m, 2H), 4.23～4.26 (m, 1H), 4.18 (t,J=6.0 Hz, 2H), 3.83～3.88 (m, 1H), 3.75 (t,J=6.0 Hz, 4H), 3.44～3.64 (m, 2H), 3.12～3.21 (m, 1H), 2.83 (t,J=6.0 Hz, 2H), 2.60 (t,J=6.0 Hz, 4H); ESI-MS (m/z): [M+H]+562.35。
A12: 白色粉末状固体; 收率60.3%; mp 155.5～156.8 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.14～8.18 (m, 1H), 7.76～7.80 (m, 2H), 7.61～7.65 (m, 1H), 7.24～7.42 (m, 2H), 6.95 (d,J=6.0 Hz, 2H), 4.44～4.81 (m, 2H), 4.28 (t,J=6.0 Hz, 2H), 4.20～4.25 (m, 1H), 3.85～3.89 (m, 1H), 3.46～3.60 (m, 2H), 3.06～3.15 (m, 3H), 1.97 (m, 1H), 0.88～1.03 (m, 4H); ESI-MS (m/z): [M+H]+532.40。
A13: 白色粉末状固体; 收率67.1%; mp 156.3～157.4 ℃;1H NMR (600 MHz, CD3OD)δH 8.17 (d,J=2.1 Hz, 1H), 7.42～7.77 (m, 2H), 7.61～7.66 (m, 1H), 7.48～7.56 (m, 1H), 7.30～7.44 (m, 2H), 6.95 (dd,J=3.0, 6.0 Hz, 2H), 4.71～4.80 (m, 2H), 4.20～4.25 (m, 1H), 4.12 (t,J=3.0 Hz, 2H), 3.81～3.85 (m, 1H), 3.45～3.59 (m, 2H), 3.04～3.16 (m, 1H), 2.21 (m, 3H), 1.96 (m, 6H), 1.71～1.83 (m, 6H); ESI-MS (m/z): [M+H]+626.38。
1.5 目标化合物体外抗真菌活性筛选
体外抗真菌实验方法参照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)提出的标准化抗真菌敏感性实验方法进行。
选取8种人体常见致病真菌作为试验菌株:白念珠菌(Candidaalbicans, Y0109)、白念珠菌(Candidaalbicans, SC5314)、近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)、光滑假丝酵母菌(Candidaglabrata)、烟曲霉菌(Aspergillusfumigates)、红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)和石膏状小孢子菌(Microsporumgypseum),均由第二军医大学长征医院皮肤科真菌研究所菌种库提供。
选取5种常用抗菌药物作为阳性对照药物:氟康唑(FCZ,≥99%)、伊曲康唑(ICZ,≥99%)、伏立康唑(VCZ,≥99%)、特比萘酚(TBF,≥99%)和两性霉素 B(AMB,≥99%),均购于上海泰坦科技股份有限公司。
采用微量液基稀释法检测化合物所合成的A1—A13对8株常见致病真菌的最低抑菌浓度值MIC80(真菌生长80%被抑制时的药物质量浓度),实验结果见表1。
从表1的体外抗真菌活性数据可以看出,大部分目标化合物均表现出一定的抗真菌活性,特别是对白念珠菌Y0109和SC5314。其中化合物A1、A2、A3、A5、A6对白念珠菌 (Y0109) 的抑制活性是伏立康唑的2倍,两性霉素B的16倍,是氟康唑的64倍,伊曲康唑的512倍;化合物A7、A8、A9、A10、A11对白念珠菌 (Y0109) 的抑制活性与伏立康唑相当。
化合物A1、A2、A6对白念珠菌 (SC5314) 的抑制活性是伏立康唑的2倍,两性霉素B的8倍,氟康唑的32倍,伊曲康唑的256倍;化合物A3、A5、A9、A10、A11、A12对白念珠菌 (Y0109) 的抑制活性与伏立康唑相当;化合物A1、A2、A4、A7、A12对近平滑假丝酵母菌的抑制活性与两性霉素B相当，是氟康唑的8倍以上；
化合物A6对近平滑假丝酵母菌的抑制活性与伊曲康唑相当;化合物A1—A7和A11对新生隐球菌的抑制活性与氟康唑相当或者优于氟康唑,但抑制活性不如其他几种阳性对照药物。
化合物A3和A7对光滑假丝酵母菌的抑制活性是两性霉素B的2倍;化合物A1、A2和A5对光滑假丝酵母菌的抑制活性与伊曲康唑相当;化合物A6、A9和A10对光滑假丝酵母菌的抑制活性与氟康唑相当;所有化合物对曲霉菌、红色毛癣菌和石膏状小孢子菌的抑制活性很弱。
表1 目标物A1—A13的体外抗真菌活性结果
总体来说,化合物A6对白念珠菌 Y0109和SC5314(MIC80均为0.125 μg/mL)以及近平滑假丝酵母菌(MIC80=1 μg/mL)具有良好的抑制活性,与伊曲康唑相比,抗菌谱较广,抗菌活性强。从构效关系角度分析,目标化合物侧链引入苯甲酰胺结构后化合物的体外抗真菌活性有所提高,可能是由于苯甲酰胺侧链结构与羊毛甾醇14-α去甲基酶的活性部位通过疏水作用、氢键作用等进行了有效结合,增强了化合物与该酶的相互作用力,从而使化合物的抗真菌活性有所提高。
顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基甲磺酸酯经过叠氮反应和还原反应生成中间体顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲胺。2-苄氧基乙醇经亲核取代反应和水解反应生成4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸。顺-[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲胺再与4-(2-苄氧基乙氧基)苯甲酸经缩合反应,钯碳氢气还原反应和亲核取代反应生成关键中间体顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-甲苯磺酸酯乙氧基)]苯甲酰胺。最后关键中间体顺-N-{[2-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-甲基-1,3-二氧戊环-4-基]甲基}-[4-(2-甲苯磺酸酯乙氧基)]苯甲酰胺与各种胺发生亲核取代反应。经文献检索,所得目标化合物均为新化合物,结构均经1HNMR和MS确证。体外抗真菌活性结果表明,引入苯甲酰胺侧链结构,可以使伊曲康唑类新化合物的体外抗真菌活性有所提高,可能是苯甲酰胺侧链结构与羊毛甾醇14-α去甲基酶的活性部位通过疏水作用、氢键作用等进行了有效结合,增强了化合物与该酶的作用力,从而增强化合物的活性。化合物A6对白念珠菌 Y0109和SC5314(MIC80均为0.125 μg/mL)以及近平滑假丝酵母菌(MIC80=1 μg/mL)具有良好的抑制活性,有进一步研究价值。
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