滕大洪，郑虹（天津市第一中心医院器官移植科，天津 300192）
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是发病率第6 位和病死率第4 位的恶性肿瘤［1］。早期HCC通过手术切除或肝移植可获得治愈，但肿瘤负荷大、血管侵犯或转移者预后较差。在符合米兰标准的HCC 肝移植3 年复发率也约20%［2］。用于早期发现及预后判断和监测治疗反应的HCC 生物标志物仍是临床重要研究方向。
近年来，“液体活检”技术通过收集体液样本获得有关肿瘤的重要表型、遗传和转录组信息，显示出作为HCC 生物标志物的重要前景。液体活检的主要形式包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、microRNA 和细胞外囊泡。不同于常见肿瘤标志物，CTC 技术可获得有生物活性的肿瘤细胞样本。CTC 下游分析可识别靶基因中的特定突变，预测治疗反应或抗性，帮助指导治疗计划。
本文将介绍CTC 当前技术，以及探索在肝移植治疗中其作为HCC 潜在诊断和预后生物标志物的作用。
在增殖浸润过程中，肿瘤细胞通过分泌基质金属蛋白酶破坏组织基底膜，进入附近血管或淋巴管。入血肿瘤细胞就成为CTC，可通过循环到达身体的不同组织。大多数CTC 会因失巢凋亡、免疫攻击或剪切应力等作用而死亡［3］。CTC 通过失去上皮型表面标志并获得间质标志即上皮间质转化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT）过程，显著提高生存和转移能力。此外，CTC 可与成纤维细胞、白细胞、内皮细胞或血小板形成聚集体，形成CTC 簇。与单个CTC 相比，CTC 簇具有更高转移潜能和生存能力［4］。CTC 并非相同克隆，而是具有不同肿瘤病灶特征的异质细胞群，具有在选择性微环境和治疗压力下改变表型和分子特征的能力［5］，原发性肿瘤内的肿瘤细胞与转移部位肿瘤细胞之间存在显著异质性。因此，CTC 检测不应视为侵入性较小的活检替代方法，而是一种全面了解全身异质肿瘤细胞状态的方法。通过CTC 揭示肿瘤分子特征、识别靶向治疗标志物，是实现精准医疗的可能途径。
液体活检的另一个重点是游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），来源于垂死的肿瘤细胞或吞噬了肿瘤细胞的巨噬细胞［6］。由于ctDNA 包含与其起源肿瘤细胞相同的基因突变，ctDNA 可用于识别异质肿瘤特异性突变和表观遗传变化，并监测正在接受治疗患者的肿瘤动态。ctDNA 已被用于治疗反应监测或复发早期检测［7］。其临床应用面临问题之一是其他组织大量cfDNA 背景下如何精确识别ctDNA。此外，ctDNA 能否代表活跃增殖和转移肿瘤细胞基因也是疑问，因为ctDNA 可能不成比例地代表更易死亡的“较弱”肿瘤细胞的DNA［8］。与ctDNA 相比，CTC 的主要优势在于可以捕获完整、有活力的肿瘤细胞。只要保留其细胞完整性，捕获的CTC 就可用于功能测定并进行培养以评估耐药性［9］。
CTC 的检测和分离可以分为3 类：基于免疫亲和的富集、基于生物物理特性的富集和无富集检测方法。
免疫亲和性检测方法：基于免疫亲和的CTC 富集技术使用针对CTC 细胞表面标志物的抗体。正富集是指通过使用针对特定肿瘤相关抗原的抗体来捕获CTC，而负富集是指通过使用针对CD45 的抗体来消耗背景中的造血细胞［10］。
CellSearch 系统使用涂有抗EpCAM 抗体的免疫磁珠分离系统［11］。微流控装置如CTC 芯片由涂有抗体的微柱组成，通过特殊几何排列以优化细胞［12］。CTC-iChip 结合了微流体和免疫磁技术，检测的灵敏度更高［13］。NanoVelcro 使用带有集成微流体混沌混合器的抗体涂层纳米结构基底，通过CTC 与基底接触以增强CTC 捕获［14］。
具有EMT 表型的CTC 表面EpCAM 等上皮标志物通常会下调或丢失［15］，可以逃避传统阳性富集系统。因此针对干细胞标志物如CD133、间充质标志物如vimentin 和癌症特异性抗原HER2、PSMA 的阳性富集策略也已经开发出来［16］。
但即使是针对多种抗原的混合抗体也可能无法涵盖CTC 抗原的异质性。负富集通过靶向和去除背景造血细胞来解决此问题。通过用抗CD45 代替抗EpCAM，可以使用磁性激活细胞分选（magneticactivated cell sorting，MACS）和CTC-iChip 等技术进行负富集［10］。单独阴性富集的缺陷是其纯度偏低［17］。
生物物理性质检测方法：CTC 的细胞大小、机械可塑性和介电迁移特性与血细胞有显著差异，能够使用诸如膜过滤、密度梯度分层、惯性聚焦和介电迁移率等技术将它们分离。这些“无标记”方法不必考虑肿瘤特定抗原的要求，分离的CTC 没有标记抗体，也使下游试验更易开展［10］。
ISET［18］和ScreenCell［19］使用轨迹蚀刻膜，而CellSieve［20］使用光刻技术，构建使CTC 损伤最小化的膜结构。Cluster-Chip 是一种独特的3D 微过滤系统，专门设计用于捕获CTC 簇［21］。微滤系统的主要优点是能够快速处理血液以富集CTC。然而，微滤系统易堵塞，且有时白细胞和CTC 之间尺寸重叠，使得结果准确度存在不足［10］。
密度梯度离心利用比重差异将白细胞和CTC 进行分离。OncoQuick 将离心和过滤相结合，CTC 捕获率较高［22］。RosetteSep CTC 使用针对广泛抗原混合物的抗体复合物将免疫亲和性与密度离心相结合［23］。由于技术可靠、成本低廉，离心被广泛用于CTC 的初始分离步骤，并与其他策略联合。
惯性聚焦利用细胞大小差异的惯性效应不同，适用于大于背景血液细胞的CTC 分离。这种方法已被结合到许多微流体装置中，显示出高灵敏度，并保持CTC 活性［24］。
癌细胞的介电特性与血细胞明显不同。Becker等［25］证明了乳腺癌细胞系、淋巴细胞和红细胞中的不同介电参数。癌细胞和血细胞之间的介电差异可能是由细胞膜的不同形态特征引起的，包括微绒毛、膜褶皱和起泡。DEP Array 技术可将单个细胞捕获在介电泳笼中，并已用于回收单个CTC 以进行高度特异性的遗传分析［26］。
无富集检测方法：所有富集技术都需要验证捕获的细胞，这可能非常耗时。高速荧光成像领域的进步推动了成像平台的发展，无需富集步骤即可直接从血液样本中鉴定CTC。成像流式细胞术使用核质比和大小等参数区分CTC 和白细胞［27］。光声流式细胞术是一种检测CTC 的独特体内直接成像方法，使用基于激光的技术实时检测静脉中的CTC［28］。
2013 年Sun 等［29］使用CellSearch 检测行肝癌切除术的HCC 患者的EpCAM + CTC，其中67%术前检测阳性。术前CTC 计数≥2 被认为是术后肿瘤复发的高危因素。使用CellSearch 的其他研究表明，EpCAM + CTC 与血管侵袭、高AFP、巴塞罗那临床肝癌分期晚、高复发率及更短生存期密切相关［30-32］。但值得注意的是只有30%～40%的HCC 细胞表达EpCAM，且EMT CTC 上皮标志物丢失，不适用基于EpCAM 的CTC 富集方案［33］。
去唾液酸糖蛋白受体ASGPR 是一种仅在肝细胞表面表达的跨膜蛋白，已用于富集方法检测HCC CTC。2016 年Zhang 等［34］用ASGPR、P-CK 和CPS1 抗体的CTC 芯片100%分离出CTC。Court 等［35］用带有EpCAM、ASGPR 和GPC3 多标志物组的NanoVelcro CTC 检测在97%的HCC 患者中捕获了CTC。
2000 年Vona 等［18］使用二维微滤系统ISET 检测肝切除术的HCC CTC，能够在术中捕获肿瘤微栓子。Vona 等［36］发现ISET 检测的CTC 数量与弥漫性肝癌、门静脉癌栓等晚期病变及更短生存期密切相关。Morris 比较CellSearch 和ISET 检测HCC CTC的能力，显示ISET 具有更为优越的性能（ISET：100%，CellSearch：28%）［37］。ISET 的缺点是难以释放CTC 用于下游遗传分析。
2016 年Liu 等［21］使用成像流式细胞术IFC，利用更高的核质比来检测CTC。Ogle 等［38］研究IFC则通过细胞大小，并将其有效性与由CK、EpCAM、AFP、GPC-3 和DNA-K 组成的多标志物组进行比较。包含大小标准的IFC 与CD45 阴性富集相结合，捕获所有阳性生物标志物CTC，以及28%不表达生物标志物的CTC。
鉴定特定肿瘤标志物和药物靶标表达可用于预测治疗反应性。Shi 等［39］使用3 种CTC 标志物MAGE3、survivin 和CEA 评估冷冻术对不可切除HCC 的疗效，发现它们在预测治疗反应方面是可靠的。2016 年Li 等［40］通过检测晚期HCC CTC pERK和pAkt 的表达状态来预判索拉非尼疗效。在pERK/pAkt 表达的不同模式中，pERK+/pAkt-CTC 与更长的无进展生存期和更高的索拉非尼反应率显著相关。Winograd 等［41］评估了在HCC 患者中表达程序性死亡配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）的CTC，发现PD-L1+CTC 可区分早期和晚期/转移性疾病。在接受抗程序性死亡蛋白1 治疗的6 例患者中，所有3 例表现出反应的患者都有PD-L1+CTC，而3 例无反应者中只有1 例阳性，表明PD-L1+CTC 可预测免疫治疗反应。2017 年，Kalinich 等［42］使用CTC-iChip 分离CTC，应用基于RNA 数字PCR检测肝脏特异性转录物，这些转录物被组合成一个单一的度量CTC 分数。CTC 评分与BCLC 分期高度相关，且在接受治疗的患者中下降。
EMT 标志物已被研究预测HCC 复发和预后。CanPatrol CTC 分析平台是一种两步技术，包括微滤和随后使用各种上皮（EpCAM、CK8/9/19）和间充质标志物（vimentin、twist）［43］。Wang 等［43］研究了62 例接受手术切除的HCC 患者，发现间充质CTC数量较多的患者复发风险增加，无病生存期缩短。其他研究显示间充质CTC 与不良临床结果之间存在相关性［44-45］。
Yi 等［46］构建了一个基于GPC-3 平台用于检测HCC CTC，对HCC 罕见CTC 的检测具有较高的特异性和敏感性。与EpCAM 和vimentin 相比，GPC-3具有更强的CTC 分离能力。CTC“阳性”计数（每7.5 ml 血液≥5 PV-CTC）与BCLC 分期存在相关性（P=0.055）。在下游检测中发现，在60%的病例中，CTC-NGS 的结果与组织-NGS 结果一致，并发现KMT2C 是一种常见高频突变基因。
Zhao 等［47］探索了CTC 在HCC 手术治疗后复发的预测作用，发现与单独分析 CTC 或 ctDNA 相比，CTC 和ctDNA 协同组合在预测复发方面表现出更高的敏感性（85.7%比75% / 70.4%），特异性为81.6%。该组合检测阴性患者的无疾病复发存活时间显著大于阳性者（HR=11.88， 95% CI=4.06 ～34.75，P ＜0.001）。
HCC CTC 存在显著异质性。Sun 等［48］报道了CTC 之间的这种显著异质性，发现不同血管腔内的CTC 的EMT 状态存在异质性，释放时主要是上皮表型，但在转运过程中转变为EMT 表型。在大小和核型方面CTC 间的异质性更大。Wang 等［49］使用减法富集和免疫染色荧光原位杂交（SE-iFISH），使用表型和核型的原位表征，发现存在比白细胞更小的HCC CTC，8 号染色体非整倍体率非常高。三倍体或多倍体CTC 的术后数量与预后不良显著相关。
2018 年Wang 等［50］报告了CTC 水平与肝移植后HCC 复发的相关性研究。这项前瞻性研究包括47 例接受肝移植并使用CanPatrol 系统至少接受2 次外周CTC 分析的病例。复发患者的基线Edmondson分期、累积肿瘤直径、微血管癌栓和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平更高（均P ＜0.05）。此外，70.2%的HCC 患者为CTC 阳性。尽管在肝移植后和随访期间，随着上皮和间质CTC 水平的增加，CTC 亚型的比例发生了变化，但在总CTC 或CTC亚型的变化与HCC 复发之间没有观察到显著的关联（P ＞0.05）。
Chen 等［51］研究了移植前RFA 与CTC 对肝癌肝移植预后的影响。通过负富集和imFISH方法检测，超二倍体并具有CEP8+/DAPI+/CD45-表型的CTC，计数临界值为1，当CTC 计数≥1 时定义为阳性。79 例患者中20 例（25.3%）肝移植后复发，其中15 例（75%）和59 例无复发患者中27 例（45.7%）CTC 呈阳性。结果显示复发与CTC 计数、肿瘤个数、肝硬化、米兰标准、UCSF 标准密切相关，而与术前AFP 无关。Kaplan-Meier 显示，与CTC 阴性患者相比，CTC 阳性患者的PFS 率较低。而CTC 阴性组和CTC 阳性组之间的OS 率无显著差异。作者认为RFA 可有效减少CTC 阳性HCC 患者的复发。移植前CTC 结果可作为HCC 患者肝移植前RFA 的指标。
Chen 等［52］另一项研究共招募50 例接受CTC检测并接受肝移植的患者。术前CTC 阳性率和术后复发率分别为52%和24%。符合米兰标准和UCSF 标准的患者复发率分别为8.7%和7.1%。CTC 阳性患者肝移植后复发时间早于CTC 阴性组〔（20.14±2.13） 个月比（ 28.75±1.56） 个月， P=0.020〕 。CTC 阴性和CTC 阳性患者的1 年无病生存率、总生存率分别为91.6%、91.7%和61.5%、88.5%。CTC 与肿瘤大小、AFP 水平、肿瘤分级和复发相关。CTC 是影响长期生存的唯一独立因素。Xue 等［53］对iFISH平台和CellSearch 系统进行了比较，两种方法检测的术前HCC CTC 百分比分别为70.00%和26.67%（P ＜0.01）。肝移植后3 个月iFISH-CTC 显著减少〔（3.04±0.93/7.5） ml至（ 1.0±0.53/7.5） ml，P＜0.05〕。术前iFISH-CTCs 水平较低（＜5/7.5ml）的患者没有复发生存期显著增加（15 个月比5.5 个月，P ＜0.01）。iFISH 平台增加了灵敏度分析，可用作CTC 的动态监测工具。CTC 水平可作为HCC 肝移植预后良好指标。
Amado 等［54］比较了接受肝切除或肝移植的肝癌患者的CTC 特征。在手术前、术后5 d 和第30 天使用Isoflux®系统在外周血样本中进行CTC 计数。纳入了41 例HCC 患者，10 例患者（24.4%）进行了肝切除，31 例患者（75.6%）接受了肝移植。两组患者术前CTC 计数相似，但术后1 个月肝移植组获得CTC 清除更为明显。术前存在CTC 簇状态与术后30 d CTC 清除不全具有相关性，且与生存率显著负相关。手术后CTC 清除不全可能是HCC 侵袭性的替代标志。Wang 等［55］分析193 例肝移植并接受术前1 d 和术后2 ～4 周CTC 检测的HCC 患者，并选择38 例在肝移植前可检测到CTC 的患者在肝移植后1 个月和肝移植后约3 个月的随访中进行连续CTC 检测。160 份术前合格血样中有85 例（53.1%）检测到术前CTC，平均CTC 计数为每5 ml中1.24±1.82（0 ～11.00）。167 例术后合格血样中有63 例（37.7%）检测到术后CTC，平均CTC 计数为0.71±1.15。连续检查CTC 的38 例患者中13 例术后早期CTC 呈阴性但后来转阳性，其中10 例（76.9%）HCC 复发。4 例CTC 持续阳性者有2 例（50.0%）复发。这12 例复发患者中，从检测到CTC 到临床诊断复发的中位时间为6.2（5.8±3.1）个月。而15 例CTC 阴性患者中只有1 例（6.7%）出现复发。肿瘤复发者的术后CTC 计数和CTC 阳性率均高于未复发患者。术后CTC 计数≥1/5 ml 可作为预测复发的潜在标志物，预测敏感性和特异性分别为59.3%和71.7%。术后CTC 计数≥1/5 ml 对AFP（≤20 ng/ml）和PIVKA-Ⅱ（≤40 mAU/ml）均阴性者也具有预后价值。作者认为术后连续CTC检测可能有助于监测HCC 复发。
外周血中的CTC 测量提供了有关患者疾病状态的实时信息。此外，CTC 可以很容易地从常规抽血中获得，对患者的风险较小。术前CTC 测量可能无法完全揭示肝移植肿瘤侵袭性和由此产生的复发风险。通过连续CTC 监测进行的术后监测有助于早期发现复发性或转移性肿瘤。此外，CTC 计数的增加可能出现在一些患者的AFP 和PIVKA-Ⅱ水平变化之前显示肿瘤复发，为检测早期肿瘤复发提供策略，并及时启动化疗、靶向药物或局部治疗等治疗方案，提高肝移植后的长期生存率。此外，结合单CTC 测序，可以为治疗管理提供许多好处。
肝移植被认为是HCC 患者的潜在治愈选择，但其疗效在很大程度上取决于术后复发的风险。优化程序确定候选人以降低肿瘤复发率仍是重要课题。作为液体活检的一种形式，CTC 在促进HCC 患者实施精准医疗方面具有巨大潜力。发展能够捕获全谱CTC 的具有高灵敏度和特异性的标准化测定方案，通过使用统一的CTC 检测平台进行更大样本量的多中心、前瞻性研究是今后这方面发展的方向。
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