(中检科健(天津)检验检测有限责任公司,天津 300309)
藤茶即显齿蛇葡萄,是葡萄科蛇葡萄属植物[1-2]。二氢杨梅素(3,5,7,3′,4′,5′-六羟基-2,3-双氢黄酮醇,Dihydromyricetin)是一种黄酮类化合物,又名双氢杨梅树皮素、白蔹素[3],广泛存在于蛇葡萄科植物中,在藤茶中的质量分数可达30%[4],在1940年首次被发现,可从藤茶茎和叶中分离得到[5]。有研究[6-11]证实二氢杨梅素可清除自由基、调节血脂,改善肠道菌群,解除酒精中毒,具有预防酒精肝、脂肪肝和抗肿瘤等作用,在食品工业中应用较为广泛,极具开发利用价值。在开发利用二氢杨梅素时,需要关注生物活性物质的安全性。目前对二氢杨梅素毒理学安全性研究仅见急性经口毒性实验报道[12-15],以大鼠为实验条件开展的急性毒性实验[16],二氢杨梅素服用剂量为5 g/kg,14 d内口服灌胃喂养,实验结束全部大鼠均存活,表明二氢杨梅素的毒性作用很小。目前,国内外尚未见重复剂量经口实验的毒理学研究,为评价二氢杨梅素亚急性经口毒性,笔者按照GB 15193.22—2014《食品安全国家标准28天经口毒性实验》方法对其开展研究。
1.1 主要试剂
二氢杨梅素(CAS号:27200-12-0),西安天丰生物科技股份有限公司,批号:NF-20190314,纯度>98%;生化诊断试剂盒,九强生物公司;血液学试剂包、染液、凝血酶原时间测试板、活化部分凝血激酶时间测试板,美国爱德士公司;尿液分析试纸条,德国西门子公司。
1.2 仪 器
ProCyte Dx血液分析仪、Coag Dx血凝分析仪,美国爱德士公司;7100型全自动生化研究仪,日本日立(HITACHI)公司;RM2235切片机,德国徕卡(Leica)公司。
1.3 实验动物
实验共使用100只SPF级SD大鼠,雌雄各半,购入时4～5周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号SCXK(京)2016—0006,动物质量合格证号:1100111911051485(雌),1100111911051486(雄)。动物饲养设施使用许可证号:SYXK(津)2018—0002,实验期间动物设施环境温度为20～25.8 ℃,日温差<3.8 ℃,相对湿度为32.7%～70.1%,换气频率>15次/h,照明时间为12 h(07:00—19:00)[17]。动物饲养于聚碳酸酯鼠盒,底铺高压蒸汽灭菌的小刨花垫料,每笼5只,每周换笼2次。鼠颗粒饲料,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2019—0008。
1.4 实验方法
1.4.1 动物处置
动物购入后适应5 d,分成6组:对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、附加对照组和附加高剂量组,其中对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组每组雌、雄大鼠各10只,附加对照组和附加高剂量组每组雌、雄大鼠各5只[18-19]。连续28 d经口给予对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠的实验样品二氢杨梅素服用剂量分别为0,1 250,2 500,5 000 mg/kg(饲料掺入法,实验样品掺入质量分数分别为0%,1.25%,2.5%,5%)。观测各组大鼠的中毒体征、食物利用率、血液学、血凝学、血生化和电解质、尿液、脏器质量、脏器质量体重比及病理学改变。附加对照组和附加高剂量组动物在染毒停止后继续恢复期观察14 d,观察毒性反应的可恢复性、持续性和迟发性毒性效应[20-21]。
1.4.2 生物样本采集
1) 血液样本采集:28 d染毒或14 d恢复期结束后,动物禁食过夜,自由饮水,腹腔注射4.5%的戊巴比妥钠进行麻醉(服用剂量为45 mg/kg),腹主动脉采血。乙二胺四乙酸抗凝血用于血液学检测,枸橼酸钠抗凝血用于血凝学检测,血清用于血清生化和电解质测定。
2) 组织样本采集:28 d染毒或14 d恢复期结束时,解剖采集脑、胰、甲状腺、卵巢、心脏、肝、脾、肾、睾丸、肾上腺、胃、十二指肠、结肠、肠系膜淋巴结、胸腺和膀胱组织样本。
1.4.3 观测指标
1) 一般观察:每日观察动物体征1次,每周称体重及摄食量,计算食物利用率,即动物每食入100 g食物所增长的体重。
2) 尿液检查:在染毒的第26～27 d和恢复期的第12～13 d进行尿液检查。用大鼠代谢笼收集4 h内新鲜尿液,使用尿液分析试纸检测尿液常规10项指标:比重、糖、胆原、蛋白、隐血、胆红素、pH、白细胞、酮体和亚硝酸盐。
3) 血液学和血凝学检测:血液学指标白细胞数(WBC)、白细胞五分类计数、血小板数(PLT)、红细胞数(RBC)、血红蛋白质量浓度(HGB)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白质量(MCH)和平均红细胞血红蛋白质量浓度(MCHC)。血凝学指标凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血激酶时间(APTT)[22]。
4) 生化系列血清和电解质检测:甘油三酯、白蛋白、总胆固醇、天门冬氨酸氨基转移酶、谷氨酰转肽酶、葡萄糖、碱性磷酸酶、钠、尿素、钾、丙氨酸氨基转换酶、肌酐、氯和总蛋白质。
5) 脏器质量和脏器系数:称心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、子宫(带宫颈)和卵巢(带输卵管)质量,脏器系数为计算脏器质量与大鼠体重之比[23-24]。
6) 病理检查:对脑、甲状腺、胸腺、心脏、肝、脾、肾、肾上腺、胃、十二指肠、结肠、胰、肠系膜淋巴结、卵巢、睾丸和膀胱进行大体剖检,制备病理切片,进行组织病理学显微镜下检查[25-26]。
1.5 数据处理
对多水平数据采用单因素方差法分析检验组间差异[27-28],以P<0.05为有统计学显著意义。若组间有显著性差异,则进行两两比较;若数据呈非正态分布,则采用秩和检验进行分析(Kruskal-wallis检验)。附加对照组与附加高剂量组采用t检验法比较。
2.1 临床体征观察
大鼠连续染毒28 d,所有染毒动物均未死亡,所有染毒动物在整个染毒期均未观察到毒性体征。当恢复期为14 d时,未观察到附加高剂量组动物出现异常表现。
2.2 摄食质量和体重检测
与对照组相比,各剂量组大鼠摄食量未发生明显改变。通过饲料掺入的方法进行受试物的给予,不影响动物正常的摄食。
染毒期间,仅在第3周高剂量组雄鼠体重与对照组相比显著降低(P<0.05);恢复期间,附加高剂量组大鼠体重与附加对照组相比均无显著差异(P>0.05);与对照组相比,各剂量组大鼠食物利用率未明显受到染毒影响。实验结果提示二氢杨梅素28 d经口染毒对大鼠体重和摄食量的增长无明显影响。
2.3 尿液检测
与对照组相比,各剂量组尿液密度未发生显著改变,其他指标结果:pH均为5～7，蛋白、糖、酮体、胆红素、胆原、隐血、白细胞均和亚硝酸盐均为阴性。实验结果提示:在实验剂量范围内,二氢杨梅素28 d经口染毒对尿液常规指标无明显影响。
2.4 血液学和血凝学检测
二氢杨梅素28 d经口染毒大鼠血凝学检测结果与对照组相比,各剂量组未发生显著改变;血液学检测结果与对照组相比,各剂量组PLC、WBC和白细胞分类计数均无显著改变(结果未列表)。实验结果提示:在实验剂量允许范围内,二氢杨梅素28 d经口染毒对大鼠血液凝固、白细胞和血小板均无明显影响。
表1 RBC、HGB和HCT的检测结果
可以通过血液学常规指标中反映红细胞大小和血红蛋白质量浓度的参数值判断贫血类型。1929年Wintrobe首次应用MCV、MCH和MCHC来描述红细胞大小和HGB[29],通过检测获得RBC、HCT和HGB,计算得到:MCV=HCT/RBC,MCH=HGB/RBC,MCHC=HGB/HCT。根据红细胞体积将贫血分为正细胞性贫血、大细胞性贫血和小细胞性贫血[30],根据红细胞血红蛋白质量浓度将贫血分为正色素性贫血、高色素性贫血和低色素性贫血,从而有助于推断可能的病因学机制[31]。研究结果表明:二氢杨梅素28 d经口染毒各剂量组大鼠的此3项指标均与对照组无显著差异,提示二氢杨梅素导致大鼠贫血分类为正细胞正色素性贫血;从外源化学物质的作用机制看,正细胞性贫血主要见于急性失血性贫血、溶血性贫血和部分再生障碍性贫血[32],二氢杨梅素造成的红细胞推测可能是溶血性贫血,即红细胞遭破坏导致数量减少。Chen等[33]虽然报道了二氢杨梅素可与人血红蛋白直接结合,但是更深入的机制未涉及。
表2 MCV、MCH和MCHC检测结果
2.5 血清生化和电解质检测
表3 血清生物化学检测结果
由表3可知:与对照组相比,各剂量组血清电解质指标未发生显著改变,生化指标个别剂量组有显著差异。在各剂量组雌大鼠28 d染毒期末,高剂量组血清葡萄糖(GLU)的测定值有显著差异(P<0.001),中剂量组血浆总蛋白(TP)与白蛋白(ALB)的测定值均有显著差异(P<0.001),低剂量组血清总胆固醇(TCHO)的测定值有显著差异(P<0.05)。与对照组比较,在各剂量组雄大鼠28 d染毒期末,高剂量组TP与ALB的测定值均有显著差异(P<0.05),中剂量组TCHO的测定值有显著差异(P<0.001)。
根据实验室历史对照数据比对和剂量—效应关系分析,血清生物化学指标的改变和给样不具有给样相关性。综合以上实验结果,笔者认为二氢杨梅素28 d经口染毒虽然对大鼠血清生物化学和电解质检测无明确毒理学意义的影响,但是不排除在一定条件下二氢杨梅素可能影响大鼠对糖、脂和蛋白质等的物质代谢,故在对二氢杨梅素降糖、降血脂保健功能的研发中,其自身对糖、脂代谢的影响应引起关注。
2.6 脏器质量与脏器体重比
考察二氢杨梅素28 d经口染毒大鼠脏器质量,包括称心脏、胸腺、肾脏、睾丸、脾脏、附睾、肝脏、子宫(带宫颈)和卵巢(带输卵管)质量、肾上腺和脏器系数比,未发现染毒相关脏器质量与脏器体重比发生显著改变。
2.7 病理学检查结果
对二氢杨梅素28 d经口染毒大鼠进行大体剖检和组织病理学检查,用肉眼观察各剂量组雄性与雌性大鼠的主要脏器大体形态,未见明显染毒相关的异常改变;将高剂量组和对照组在光学显微镜下进行病理组织学观察,在高剂量组中未发现有与实验样品明显相关的特异性改变。
在笔者设置的6组研究条件下,二氢杨梅素28 d经口染毒性对SD大鼠未观察到有害作用每天剂量NOAEL:雌性大鼠为1 250 mg/kg,雄性大鼠为2 500 mg/kg;最小观察到有害作用每天剂量LOAEL:雌性大鼠为2 500 mg/kg,雄性大鼠为5 000 mg/kg。附加高剂量组停止染毒后观察14 d,其毒性效应可以恢复。该研究在国内外首次发现二氢杨梅素亚急性经口摄入导致红细胞生成损害,提示红细胞系统可能是长期摄入二氢杨梅素的毒作用靶点,应引起保健食品研发者的关注。
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