常豆豆，王从丽，李春杰*
（1.中国科学院东北地理与农业生态研究所/大豆分子设计育种院重点实验室，哈尔滨 150081；
2.中国科学院大学，北京 100049）
昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes，EPN）自然存在于土壤中，是一种专性寄生昆虫的线虫。大量研究证明，这类线虫可侵染和杀死鳞翅目和鞘翅目等昆虫幼虫，对环境、植物及非靶标生物无副作用，在害虫生物防治中发挥着重要作用。昆虫病原线虫分为斯氏科 Steinernematidae、异小杆科Heterorhabditidae[1]，用于害虫生物防治的昆虫病原线虫主要包括斯氏属Steinernema和异小杆属Heterorhabditis。目前已发现和鉴定出100多种Steinernema和Heterorhabditis[2]。昆虫病原线虫与体内细菌共生，共生细菌包括肠杆菌科的致病杆菌属Xenorhabdus与发光杆菌属Photorhabdus，分别与Steinernema和Heterorhabditis线虫共生。肠道内携带共生菌的侵染期线虫（infective juveniles，IJs）自由生活在土壤环境中，主动寻找并侵入合适的寄主，随后释放体内共生细菌到寄主昆虫血腔内，细菌迅速繁殖并产生毒素，使寄主于48 h内患败血症而死亡。线虫和细菌利用寄主体内组织作为营养进行繁殖；
当寄主体内营养消耗殆尽，侵染期线虫从寄主体内爬出并寻找新的寄主。在寄生过程中，线虫依赖于共生细菌杀死其寄主昆虫，共生细菌产生抗生素抑制可竞争的次级微生物，将寄主组织分解成可利用的营养物质，并作为食物来源，从而为其繁殖创造一个合适的环境[3]。共生细菌需要线虫来保护自己不受外界环境的影响，被释放到寄主血腔，并抑制寄主的抗菌蛋白[1]。线虫与共生细菌形成致病复合物，其中共生细菌的致病机制被学者们普遍阐明，但是近年来研究表明致病复合物中线虫表皮化合物及其共生细菌表面结构是与寄主早期互作的重要组成部分，避免被寄主昆虫免疫系统识别[4]，而在侵染后期，线虫和细菌分泌物共同作用改变寄主的生理平衡，使其患败血症而死亡。本文主要综述斯氏属线虫及异小杆属线虫的表皮免疫机制、分泌蛋白鉴定和功能，以及致病机制等研究进展，为深入揭示这类线虫的致病机制提供参考，为这类生物农药的高效研发提供新思路。
当自由生活的 IJs到达目标昆虫，它会面对寄主的第一道防线，即物理结构障碍，如角质层和中肠营养膜等，当这些屏障被打破后，昆虫通过细胞和体液免疫反应保护自己免受细菌或线虫感染[5]。细胞免疫反应包括血细胞的吞噬、结瘤及包埋[6]，体液免疫包括可诱导的抗菌肽、细胞黏附分子、溶酶菌、凝集素、黑化作用等[7,8]。而IJs为了克服寄主体液或细胞免疫反应并成功寄生，主要采取免疫逃避和免疫抑制两种策略。免疫逃避是线虫合成与寄主抗原相关的分子（被称为self-proteins）或获得寄主的分子化合物，将这些分子物质覆盖在线虫的体表来逃避寄主的免疫[9]；
免疫抑制是线虫通过排泄/分泌各种化合物来干扰或中和寄主在应对侵染时引发的免疫[10]。线虫在不同侵染阶段采取不同的策略：在侵染寄主早期（0～3 h），线虫和细菌通过表皮复合物的免疫逃避策略避免寄主酚氧化酶原系统（Prophenoloxidase system）和血细胞识别；
在侵染寄主后期（3 h以后），IJs及其共生细菌释放各种毒性因子，如蛋白酶、酚氧化酶抑制剂和毒素来抑制寄主的免疫反应[11]。
2.1 共生细菌的致病性
线虫成功寄生过程即对寄主致病过程。多数国内外学者关注线虫体内共生细菌在致病过程的作用，认为昆虫病原线虫释放Photorhabdus或Xenorhabdus共生细菌后，细菌的表面成分如菌毛、鞭毛蛋白首先发挥作用，阻止吞噬和结瘤过程，避免被寄主免疫血细胞识别[12]，随后，共生细菌分泌毒力因子，包括毒素复合物、蛋白酶、脂肪酶和脂多糖等抑制寄主的免疫反应[13]，克服昆虫的体液和细胞防御机制，细菌在血腔繁殖并在48 h内使寄主患败血症而死亡[14,15]；
共生菌还会产生有毒的次级代谢物，不仅对寄主昆虫是致病的，而且还会阻止其他的细菌和真菌利用富含营养的昆虫尸体[16]。
在致病性和营养关系方面，异小杆属线虫与发光杆菌之间共生关系的专一性比斯氏属线虫与致病杆菌更为严格[17]。在体外无菌培养时，斯氏属线虫被成功培养，而异小杆属未被成功培养[18]，只有当无菌异小杆属线虫在非特异性发光杆菌培养条件下才能得以繁殖[19]。Han和Ehlers[17]研究阐明了H.bacteriphohora和S.carpocapsae侵染期线虫对其共生细菌的营养依赖性，及这两种无菌线虫在无菌大蜡螟Galleria mellonella体内的发育和致病性。将无菌H.bacteriphohoraH06线虫与其非特异性的发光杆菌离体培养，产生体内无菌（axenic）的侵染期线虫，用该线虫侵染无菌大蜡螟，线虫发育受阻并且无法致死大蜡螟；
无菌S.carpocapsae在大蜡螟体内可以发育为成虫并繁殖，在3 d后杀死寄主昆虫；
而Hallem等[20]培养无菌H.bacteriphohora可以致死黑腹果蝇Drosophila melanogaster，无菌线虫H.downeseiy可以致死寄主昆虫烟草天蛾幼虫Manduca sexta[21]，表明不同昆虫对异小杆属线虫的响应不同，斯氏属和异小杆属线虫自身均有抵御昆虫免疫的能力。
2.2 线虫的致病性
已有研究表明昆虫病原线虫刚侵入寄主体内不能立刻释放共生细菌，斯氏属格氏线虫S.glaseri侵染寄主4～5 h后释放致病杆菌[22]，异小杆属线虫H.bacteriphohora侵染寄主半小时后释放发光杆菌[23]，因此，在侵染的早期阶段，避免被寄主昆虫的免疫识别是线虫成功寄生的关键。一些学者研究了斯氏属和异小杆属线虫致病过程，线虫在线虫-细菌复合体的致病性中，不仅具有“活注射器”的功能，而且还在侵入寄主后的不同时期通过表皮和其他分泌物的联合作用来逃避和抑制寄主昆虫的免疫。
2.2.1 斯氏属线虫表皮复合物对寄主的免疫调节 线虫表皮是指线虫身体最外层结构，又称为外鞘，与线虫的上表皮松散连接[24]。Blaxter等[25]提出了线虫角质层免疫规避作用的一般模型，侵染期线虫表面外膜（surface coat）在逃避昆虫免疫过程中发挥重要作用。侵染期线虫表皮由碳水化合物、脂类和蛋白质等物质组成，带负电荷，处于动态变化中，其组分不断被合成，并且向寄主扩散。研究表明S.feltiae表皮脂质可以与来自大蜡螟血淋巴因子相结合，在线虫周围形成一层薄膜，这种非特异性的薄膜可以逃避寄主血细胞识别[26]，S.glaseri表皮蛋白模拟昆虫对侵染期线虫表皮特定蛋白的识别进而逃避寄主免疫[27]。在斯氏属线虫侵染的早期阶段，即共生细菌在寄主血腔被释放之前，线虫和寄主昆虫免疫系统相互作用过程中，线虫体表化合物，即脂质和蛋白质等首先接触昆虫免疫系统发挥其免疫抑制功能[4]。
2.2.1.1S.feltiae表皮脂质的免疫抑制 Dunphy和Webster[28]鉴定了S.feltiae部分表皮成分可抑制大蜡螟血细胞包埋，用脂肪酶处理表皮会导致其抑制特性的丧失，推测角质层脂质的变化导致可识别抗原的暴露；
同样，Brivio等[29]研究发现S.feltiae表皮可抑制大蜡螟免疫反应，提取S.feltiae的表皮也可抑制酚氧化酶活性，进而证实该线虫体表参与免疫抑制。进一步研究结果表明这一特性是由表皮上脂类物质发挥作用，从S.feltiae表皮上提取的脂类可以抑制大蜡螟酚氧化酶活性及血细胞包埋反应[30]和抗菌肽的合成[31]。表皮脂类物质之所以抗免疫活性是因为能够结合昆虫体内的寄主互作蛋白（host-interacting proteins，HIPs）[26,30]。寄主互作蛋白是寄主免疫反应中与外源物互作的一类蛋白的总称，脂类与寄主互作蛋白的结合导致血淋巴中寄主互作蛋白浓度降低，阻止了酚氧化酶原系统激活和黑色素包埋所需的血淋巴丝氨酸蛋白酶的激活，从而抑制寄主免疫反应[31]。从S.feltiae和大蜡螟相互作用之间关系可以看出，这种线虫表皮脂质实施的免疫抑制策略能够中和寄主昆虫的免疫防御引起寄主发病。
通过角质层的研究可以排除由线虫分泌物或其共生细菌造成的影响，并避免使用无菌性线虫，因为共生菌的缺失可能会在生理上发生改变。关于S.feltiae线虫表皮脂类功能研究相对比较清楚，其具体成分或分子靶标已有报道。Lu等[32]认为S.feltiae的侵染期线虫表皮对寄主免疫的抑制作用来源于线虫自身的分泌蛋白，潜在地粘附在表皮上。
2.2.1.2S.glaseri表皮蛋白的免疫抑制功能 在斯氏属S.glaseri中同样观察到表皮的免疫抑制，但发挥作用的是表皮蛋白。Wang等[33]发现没有共生细菌的S.glaseri抑制日本金龟子Popillia japonica血细胞包埋和黑化作用，说明S.glaseri自身可以分泌抑制昆虫免疫的物质；
用乙醇粗提取S.glaseri表皮蛋白并测试活性，发现该表皮蛋白可使异小杆属线虫H.bacteriophora在日本金龟子体内存活率提高四倍，进一步分析粗提物，表皮蛋白中含有至少一种与昆虫血细胞免疫相关的蛋白，其中表面外膜蛋白（surface coat protein 3a，SCP3a）可抑制血细胞对外来物的吞噬，降低寄主血细胞数目，表现出强烈的免疫抑制效果[26]。刘华[34]也从S.glaseri表皮蛋白粗提物中分离纯化了一个具有抑制昆虫血细胞吞噬作用的蛋白组分，经过双向电泳分离和二级质谱鉴定，获得了免疫抑制蛋白的序列信息，序列分析证实免疫抑制蛋白与多个物种烯醇化酶（enolase）具有较高同源性，具备烯醇化酶家族的各种特征，将其命名为 Sg-ENOL（S.glaserienolase）。免疫电镜分析证实天然的 Sg-ENOL 位于线虫表皮，同时发现Sg-ENOL也存在于线虫肌肉组织中。S.glaseri在昆虫源物质诱导下会分泌Sg-ENOL，而无诱导物时不会分泌；
在进入寄主体内后开始分泌Sg-ENOL，证实Sg-ENOL与S.glaseri侵染过程密切相关。
斯氏属线虫侵入寄主昆虫体腔后，表皮复合物在抑制昆虫免疫过程中发挥重要作用，但线虫在生活史中蜕皮 4次，外表皮层在组成和组织上会发生改变，这与线虫的外部环境有关[25]。另外，用不同来源的培养基繁殖S.glaseri线虫的表皮蛋白组成和活性存在差异，活体和离体培养S.glaseri后进行裂解血细胞试验，结果表明源于大蜡螟培养的S.glaseri的表皮蛋白表现出强烈的裂解血细胞活性，而源于人工培养基繁殖的S.glaseri的表皮蛋白活性不明显[35]。刘劲和刘华[36]通过比较S.glaseri侵染期线虫表皮蛋白和分泌蛋白，发现线虫的免疫抑制作用主要是由分泌蛋白产生的；
而自身表皮上的蛋白，虽然也具有一定的免疫抑制活性，但含量相对较低，活性很弱。线虫侵入寄主早期，表皮蛋白帮助逃避昆虫的血细胞包埋，线虫在与寄主体内物质接触后，线虫自身分泌物通过体表分泌到昆虫血腔，对寄主的致病作用起着促进作用。
2.2.2 斯氏属线虫分泌蛋白的致病性 线虫排泄/分泌（excretory/secretory，ES）产物既是有效的免疫原，在线虫的致病力和寄主环境适应性上起到了重要作用。S.feltiae、S.glaseri以及S.carpocapsae[37]等斯氏属线虫除了自身表皮复合物对寄主的免疫抑制作用，协助分泌蛋白和共生细菌等致病因子致死昆虫，许多研究者发现斯氏属线虫还可利用分泌物调节免疫功能，是对寄主的主要致病因子。分泌物是由不同种分子组成的混合物，学者们重点关注并解析其中的蛋白。线虫通过分泌蛋白（excretory/secretory protein，ESP）破坏寄主先天免疫反应，增强其在寄主内存活和致病。最初主要通过基因重组蛋白[38]、色谱纯化法[39]、表达序列标签（expressed sequence tag，EST）[40]等方法对线虫分泌蛋白进行鉴定，随着组学研究技术的发展，近年来转录组学及蛋白质组学被用于分泌蛋白的鉴定。
2.2.2.1 线虫分泌蛋白的鉴定及其功能 蛋白酶是寄生虫感染和生长过程中产生的最丰富的酶，在寄生过程中发挥着重要作用[41]。目前多个斯氏属线虫寄生相关基因已被鉴定，这些基因编码不同的蛋白酶，通过分子生物学等研究方法从S.carpocapsae的分泌产物中鉴定了5种丝氨酸蛋白酶及1种丝氨酸蛋白酶抑制剂、1种金属蛋白酶和2种天冬氨酸蛋白酶，表达分析结果表明这些基因在寄生阶段表达量增加，同时其基因功能、致病机制已被明确，部分效应子是通过调控线虫的寄生、降解寄主组织、抑制寄主昆虫的免疫反应等来调控其致病机制，具体蛋白的详细功能如表1。
表1 已被鉴定的S.carpocapsae分泌的蛋白及其功能Table 1 The secreted protein and its functions of S.carpocapsae identified
斯氏属线虫能分泌蛋白质（主要是蛋白酶）参与寄主免疫抑制，帮助线虫感染寄主并在寄主内生存。但蛋白酶在寄主-寄生虫相互作用中的确切生物学作用及蛋白酶分泌来源尚不清楚，以上研究斯氏属的ESP都是在感染环境之外进行鉴定，在寄主免疫抑制与逃避及组织损伤中发挥作用，是调节免疫的活性分子；
而Lu等[32]与Chang等[49]对S.carpocapsae及S.feltiae在无菌条件下分泌蛋白进行组学分析和在寄主体内活性分析，挖掘斯氏属线虫分泌蛋白中发挥毒性作用的核心蛋白，进一步验证斯氏属线虫在促进线虫-细菌复合物的致病性方面具有更积极的作用，而不是简单地依赖于它们的共生细菌。
2.2.2.2 斯氏属线虫分泌蛋白的组学分析 当自由生活侵染期线虫侵染寄主时，会发生显著的形态变化，这个过程被称为“激活”，代表了线虫生命周期中从自由生活转换为主动寄生，研究ESP需要设计一种模拟自然侵染条件的试验，以便获得与自由生活的个体产生的尽可能相似的ESP[50]。Lu等[32]与Chang等[49]通过寄主昆虫匀浆分别激活S.carpocapsae和S.feltiae侵染期线虫，并收集线虫分泌的蛋白，两种线虫的蛋白对果蝇、家蚕Bombyx mori和大蜡螟3种昆虫均具有致病性，因ESP的毒性和在寄主体内的快速扩散特征，称其为毒液蛋白。凝胶电泳分析从无菌S.carpocapsae侵染期线虫中收集到的ESP与从带共生细菌的侵染期线虫中收集到的ESP具有相似的蛋白图谱，并且从两个群体中收集到的ESP具有相似的毒性。但斯氏属不同种线虫的ESP含量和组成存在显著差异，当暴露寄主组织6～30 h，S.feltiaeESP的含量是波动且下降的，而S.carpocapsae的ESP较稳定且数量缓慢下降，表明这两种线虫可能利用不同的策略建立寄生关系。为了战胜并杀死寄主昆虫，S.feltiae可能对其共生细菌X.bovienii有更强的依赖性，在激活和释放共生细菌后不久，侵染期线虫可能会将它们的生存策略从杀死寄主转变为生存、取食和发育。通过分析未激活和激活侵染期线虫的转录组，发现在IJs激活期间，即线虫早期寄生阶段的基因表达发生了变化。
质谱分析了毒液蛋白质组，发现毒液蛋白是一种包含许多种蛋白质的复杂混合物，不同种线虫的毒液蛋白包含的结构域有差异，S.carpocapsae的毒液蛋白中除了含有上述（表1）的蛋白酶及蛋白酶抑制剂，还检测到了毒素相关蛋白，如含Shk结构域蛋白和脂肪酸及视黄醇结合蛋白，这些蛋白是抑制寄主免疫系统的潜在候选蛋白。而同样的在S.feltiae鉴定的266种S.feltiae毒液中含量最多的蛋白质组是丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。基因同源性分析发现 52个共同的毒液基因高表达，代表了这两种斯氏属线虫共有一个核心效应蛋白。在这组关键的ESP中，有肽酶、糖基水解酶、凝集素以及可能参与免疫调节的蛋白质，如FAR（fatty acid/retinol binding protein）蛋白、免疫球蛋白和免疫球蛋白样蛋白。这些关键毒液蛋白的具体功能尚不清楚，但它们在S.carpocapsae和S.feltiae之间的保守性表明它们在多种昆虫寄主中起着重要的寄生作用。
2.2.3 异小杆属线虫表皮的免疫抑制作用 Bedding和Molyneux[51]的研究结果表明侵染期异小杆属线虫有独特的头部端齿结构，能够穿透寄主的表皮和节间膜便于线虫侵入。异小杆属线虫除了在寄主昆虫内释放共生细菌外，侵染期线虫还可抑制寄主昆虫的免疫反应[52,53]。Eleftherianos等[21]发现无菌异小杆属线虫H.downesei能够有效地抑制烟草天蛾细胞免疫反应，如血细胞的数量、血细胞的吞噬能力和血细胞聚集。侵染寄主早期，异小杆属线虫的表皮干扰寄主的细胞免疫和体液免疫。侵染期线虫保留2龄表皮（J2-cuticle）称之为包鞘（ensheath）幼虫，出鞘（exsheath）标志着线虫褪去2龄表皮，从自由生活过渡到寄生生活[54]。斯氏属线虫的J2-cuticle在土壤移动过程中容易褪去，但异小杆属线虫J2-cuticle较稳定，这种表皮有助于线虫避免昆虫Tipula oleracea的细胞包埋[55]，Yi等[56]研究表明H.bacteriphohora表皮通过抑制在寄主免疫应答中发挥关键作用的必需活性因子——类花生酸（Eicosanoids），进而抑制大蜡螟的血细胞密度、微聚集、吞噬和包埋、无细胞血淋巴酚氧化酶和抗菌活性，但表皮中是何种成分发挥免疫抑制的关键作用尚不清楚。
2.2.4 异小杆属线虫分泌蛋白的致病性 随着分子生物技术的发展和组学的出现，线虫在侵染早期的转录反应与基因组[57]和转录组学研究相结合，阐明可能参与致病的特定基因或基因家族。Adhikari等[58]通过转录组学研究检测到H.bacteriphohora与寄主相互作用中，分泌或排泄的一些潜在分子与毒力相关的基因表达模式，推测这些分泌物在昆虫寄生和抑制寄主防御机制中发挥重要作用。Vadnal等[59]对H.bacteriophoraIJs在烟草天蛾幼虫血淋巴中孵育9 h后进行了转录组测序，使用qRT-PCR验证了上调和下调的基因亚群，揭示了一系列候选寄生基因。Moshayov等[60]将H.bacteriophora在大蜡螟体内孵育，通过反转录、构建抑制性消减杂交文库及表达序列标签等分子生物学方法鉴定出寄生期间高表达的23个基因。Hao等[61]在H.bacteriophora中鉴定出凝集素、金属蛋白酶、烯醇化酶、几丁质酶、表面相关抗原等与寄主昆虫互作的相关基因，分别在逃避寄主免疫和寄主组织降解等过程中发挥作用。
线虫在侵染寄主昆虫的后期分泌毒性因子作用于寄主昆虫[62]，如表2。异小杆属H.bacteriophora在寄主体内分泌特定类型的胞外蛋白酶选择性地降解昆虫的抗菌蛋白——天蚕抗菌肽（cecropin），使寄主抗菌免疫失活，促进共生细菌P.luminescens在昆虫体腔内定殖[63,64]。H.bacteriophora线虫分泌物通过抑制黑腹果蝇的 Imd（Immune deficiency）通路促进共生细菌侵染[65]，产生的 UDP葡萄糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase）抑制昆虫蜕皮激素的活性及抗菌肽基因表达[66]，丝氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidase）和无脊椎动物型溶菌酶 （lysozyme）等引起昆虫黑化、细胞反应、抑制抗菌肽合成[67]。Eliáš等[68]研究表明H.bacteriophora侵染期线虫分泌蛋白抑制寄主的酚氧化酶活性，纯化筛选出38 kDa的肽段被鉴定为酚氧化酶抑制化合物的主要候选来源，通过质谱和重测序方法进一步分析，在这一活性ESP片段中鉴定了6个肽序列，包括参与泛素化和免疫通路调控的蛋白质；
Noguez等[69]研究表明由H.bacteriophora线虫产生的小分子信息素可以调控线虫的生长发育进而促进毒性发挥。
表2 已被鉴定的H.bacteriphohora分泌的蛋白及其功能Table 2 The secreted protein and its functions of H.bacteriphohora identified
异小杆属线虫H.bacteriophora分泌的蛋白中调节寄主免疫蛋白的分子鉴定及功能已经明确，但分泌蛋白中发挥毒性作用的关键蛋白尚不清楚，关于异小杆属线虫分泌蛋白的组学分析尚未见报道。
本文综述了广泛研究的斯氏属和异小杆属线虫致病机理方面的研究成果，例证除了共生细菌对昆虫发挥致病作用外，昆虫病原线虫自身还能通过两种方式促进昆虫致病：侵染寄主早期，通过表皮复合物抑制寄主免疫，为线虫和携带的细菌分泌物的释放创造合适的血淋巴环境；
当线虫到达寄主血腔后，通过分泌具有免疫调节的蛋白破坏寄主组织或具有毒性的蛋白杀死寄主。因此，线虫通过分泌多种有活性的毒性物质致死寄主，而不是归因于任何单一的分泌产物的作用。但目前仍然有许多问题值得深入研究，如线虫分泌蛋白的靶标蛋白和具体功能，分泌蛋白的具体来源及作用途径尚不清楚；
在生物防治应用实践中，能否利用现代分子生物学对已挖掘的线虫寄生基因进行遗传改良以提升线虫的生物防治效果[70]。昆虫病原线虫在环境中面临着各种生物和非生物因素的干扰，环境生物因素包括同类线虫、共生细菌、寄主昆虫、寄生真菌以及其他昆虫病原等；
环境非生物因素主要有土壤类型、温湿度、盐度、紫外线等[71]。昆虫病原线虫在不同逆境中对寄主昆虫的致病过程中毒素蛋白是否也发挥着作用还是空白。因此需要深入研究昆虫病原线虫的致病机制，尤其是毒性蛋白的深入研究将备受关注，包括毒性蛋白的分离、鉴定、合成、功能验证、杀虫机制及应用潜力等。毒性蛋白方面的研究将不仅有助于理解侵染期线虫寄生机制以及线虫与寄主的互作机制，而且将提高对昆虫免疫知识的认知，也将为设计新的生物杀虫剂提供新材料，对害虫高效生物防治具有重要的促进作用。
