冯云霞，张 书，谢沛霖，朱 旭，赵晓雯
（武汉市中西医结合医院 武汉 430022）
高脂血症（Hyperlipidemia，HLP）是一类代谢紊乱性疾病，其本质是人体内脂质代谢、转运的紊乱，其临床特点是患者血浆中胆固醇（Total cholesterol，TC）和甘油三酯（Triglyceride，TG）水平升高，并且是各类心脑血管疾病诸如脂肪肝、动脉粥样硬化、冠心病等的重要诱发因素[1-2]。近年来，随着人们生活条件的改变，脂肪摄入与运动消耗比例失衡，使高脂血症的发病率日益升高，严重威胁着人们的健康[3]。
西医是高血脂症常用治疗方法，但是由于西医治疗产生较大副作用，对生理、心理造成较大创伤，影响治疗效果[4]。而在我国，中药联合西药治疗效果更显著，且长期遵医嘱服药治疗效果远比停止治疗效果更明显[5]。因此，为了更显著地提高治疗高血脂症的效果，开发中医药中对其治疗的优势疗法势在必行。
腺苷5"-单磷酸激活的蛋白激酶/雷帕霉素的哺乳动物靶标（Adenosine 5"-monophosphate -activated protein kinase/ mammalian target of rapamycin，AMPK/mTOR）信号通路在细胞内构成一个合成代谢和分解代谢过程的开关[6-7]，在高血脂、高血糖等引起的氧化应激中被认为会过度激活mTOR通路，随之可影响胰岛素信号通路，导致糖脂代谢紊乱加剧，促进肝损伤的发生[8]。对此，针对AMPK通路进行的治疗具有良好的作用，可用于治疗代谢性疾病如糖尿病、肥胖、炎症和癌症等[9]，研究控制该通路是重要的研究方向。
辛温通阳中药葱白提取物，指的是从葱科植物细香葱（Bulbus Allii Fistulosi）成熟茎下端葱白中提取的一类活性成分，在最近的中医药研究指出，具有抗氧化损伤、改善缺血心肌的能量代谢、减少炎症因子分泌、调节血脂的作用[10-11]。但葱白提取物对但其治疗高血脂的机理暂时不清楚。因此，本课题以大鼠高脂血症动物模型为研究对象，灌喂葱白提取物予以治疗，初步探讨中药葱白提取物对高脂血症大鼠AMPK/mTOR信号通路的影响，为临床上高脂血症的治疗领域提供理论与实验基础。
1.1 实验动物
健康的雄性6周龄SD大鼠48只，每只体重约180-220 g，实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0104；
于温度22-26℃，相对湿度50%-60%的饲养条件下进行饲养，人工光照明暗各12 h。本实验中所有实验操作人员均具备《实验动物专业技术考试合格证书》。所有动物实验均符合动物管理委员会《实验动物伦理证》的相关规定。
1.2 试剂
葱白提取物（取自博心通软胶囊，批准文号：鄂药制字Z20180167），戊巴比妥钠（货号P3761，sigma merck公司）；
胆固醇，胆酸钠，甲基硫氧嘧啶，吐温-80，丙二醇，辛伐他丁（货号分别为C104028，S161419，H109550，T104865，P103433，S129538 阿拉丁公司）；
猪油（展艺公司）；
葱白提取物（武汉市第一医院）；
TC测试盒，TG测试盒，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）测 试 盒 ，丙 二 醛（Malondialdehyde，MDA）测 试 盒 ，琥 珀 酸 脱 氢 酶（Succinate dehydrogenase，SDH）测试盒（货号分别为A111-2-1，A110-2-1，A001-3-2，A003-1-1，A022-1-1，南京建成公司）；
伊红，苏木素（货号分别为C0109，C0107，碧云天公司）；
饱和油红“O”染色液，甘油明胶封片剂（货号分别为G1015，G1402，Servicebio公司）；
OCT包埋剂（货号4583，Sakura公司）；
化学发光试剂（货号为WBKLS0500，millipore公司）；
雷帕霉素的哺乳动物靶标（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白一抗，腺苷5"-单磷酸激活的蛋白激酶（Adenosine 5"-monophosphate -activated protein kinase，AMPK）蛋白一抗，乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl Coenzyme A Carboxylase，ACC）蛋白一抗，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH）蛋白一抗，山羊抗兔IgG（货号分别为PAB30674，PAB30970，PAB39566，PAB36269，SAB43714，bioswamp公司）。磷酸化mTOR蛋白一抗（p-mTOR），磷酸化AMPK蛋白一抗（p-AMPK），磷酸化ACC蛋白一抗（p-ACC）（货 号 分 别 为 ab137133，ab133448，ab68191，abcam公司）。
1.3 仪器
全自动生化分析仪（型号BS-420，深圳迈瑞公司）；
酶标分析仪（型号AMR-100，杭州奥盛公司）；
正置显微镜（型号DM1000，徕卡显微系统有限公司）；
石蜡切片机（型号VCM-3558，维克科教公司）；
摊片烤片机（型号TK-218V，泰维公司）；
生物组织包埋机-冷冻机（型号RD-BM/ML，源达鑫）；
生物组织包埋机（型号KD-BM，科迪公司）；
自动组织脱水机（型号ZT-12M，亚光病理公司）；
全自动化学发光分析仪（型号Tanon-5200，上海天能公司）；
电泳仪（型号mini protean 3 cell，美国Bio-Rad）。
2.1 大鼠高脂血症模型构建
设置正常组5只为空白对照，不进行任何处理。另外25只SD大鼠根据毛新民等[12]的方法配制脂肪乳：丙二醇30%、猪油20%、吐温-80 20%、胆固醇10%、胆酸钠2%、甲基硫氧嘧啶1%、加水至100%制成脂肪乳，采用脂肪乳灌胃法构建大鼠高脂血症模型。按照脂肪乳10 mL·kg-1·d-1灌胃，10天即可造成高脂血症模型。造模10天后，收集大鼠血清进行全自动生化检测血清内TC及TG含量进行模型鉴定。
2.2 分组干预
除空白对照组外，将构建成功的高脂血症大鼠模型随机分为5组，每组5只：模型组、葱白低剂量组、葱白中剂量组、葱白高剂量组、辛伐他丁组。空白对照组与模型组大鼠每天分别灌喂生理盐水，葱白低剂量组每天按25 mg·kg-1的剂量灌胃葱白提取物，葱白中剂量组每天按50 mg·kg-1的剂量灌胃葱白提取物，葱白高剂量组每天按75 mg·kg-1的剂量灌胃葱白提取物，辛伐他丁组每天按100 mg·kg-1的剂量灌胃辛伐他丁，连续4周灌喂。于给药第4周末处死动物，大鼠3%戊巴比妥钠40 mg·kg-1腹腔注射麻醉，取血后，戊巴比妥钠过量麻醉致死（100 mg·kg-1），以动物无呼吸无心跳判断动物死亡。后观察记录肝组织重量，收集各组大鼠的肝脏、血清样本备用。
2.3 各组大鼠血清脂质含量检测
于4℃融解待测血清样本，用深圳迈瑞BS-420型全自动生化分析仪检测大鼠血清中TG、TC、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein，HDL-C）的含量，检测试剂为深圳迈瑞配套生化试剂盒。
2.4 肝脏组织形态学的观察
将固定好的肝脏组织切取0.3 cm的厚度，按常规步骤脱水浸蜡包埋。切片厚度取3 μm并进行水浴处理后，将切片小心贴附于载玻片上，再放入展片器展片，贴平粘紧后烤片。根据苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosinstaining，HE）的步骤对组织切片进行染色并通过显微镜拍照，再利用Leica Application Suite 图象系统采集样本相关部位。
2.5 生化方法检测各组大鼠肝脏组织中TC、TG、SDH、SOD及MDA含量
根据TC测试盒、TG测试盒、SOD测试盒、MDA测试盒和SDH测试盒的说明书，对大鼠的肝脏组织进行检测相关指标。
2.6 油红“O”染色法观察各组肝脏组织脂质沉积情况
用手术刀将肝脏组织修平整后，用OCT包埋剂包埋切片，取厚度5-8 μm并贴于载玻片上。冰冻切片干燥30 min后，固定洗涤并使用60%异丙醇浸洗。使用油红“O”染液染色10 min（加盖避光），洗片后用苏木素染核3-5 min，最后用甘油明胶封片并通过显微镜拍照，使用Leica Application Suite 图象系统采集样本相关部位。
2.7 Western blot法检测各组大鼠肝脏组织中AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达
在裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂；
将肝脏组织剪成细小的碎片，按比例加入裂解液（每20 mg组织加入200 μL裂解液），于匀浆器中进行彻底匀浆。裂解后的样品放入离心机中，在4℃下用10000 r·min-1的转速离心力离心15 min，取上清，按照试剂盒说明书，测定蛋白质浓度。将各组样品进行电泳，电转至硝酸纤维素膜。膜放入5%的脱脂牛奶中，于室温摇床封闭2 h。分别加入一抗mTOR（1∶1000）、AMPK（1∶1000）、ACC（1∶1000）、GADPH（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）、p-AMPK（1∶1000）、p-ACC（1∶5000），于 4℃孵育过夜。洗膜3次后，孵育山羊抗兔二抗（1∶10000），室温1 h。取化学发光液A和B等量混匀，洗膜3次后，将膜放置在暗室中，将发光液充分加在膜的正面。然后将膜放置在全自动化学发光分析仪中，调节扫膜条件进行扫膜，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。
2.8 统计学处理
采用SPSS 19.0进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
3.1 血清脂质含量检测
造模后进行生化检测显示（见表1），模型组与对照组相比，大鼠的血清中TC与TG含量显著升高（P＜0.05），证明造模成功，可分组干预进行实验。干预实验4周后，与空白对照组相比，模型组大鼠血清中TC（6.90±0.24）mmol·L-1、TG（3.29±0.10）mmol·L-1、LDL-C（3.40±0.16）mmol·L-1显著升高，HDL-C（1.03±0.02）mmol·L-1显著降低（P＜0.05）；
葱白提取物与辛伐他丁组和与模型组相比，大鼠血清中的TC、TG和LDL-C显著降低（P＜0.05），HDL-C水平显著上升（P＜0.05）。在3个剂量中，葱白高剂量组的效果最明显，TC（5.22±0.07）mmol·L-1、TG（1.37±0.02）mmol·L-1和LDL-C（2.13±0.03）mmol·L-1水平都显著下降，HDL-C（1.71±0.02）mmol·L-1水平（P＜0.05）显著上升。
表1 各组血清脂质含量比较
图1 不同分组的肝脏组织HE染色结果
表2 各组肝组织生化检测结果比较
3.2 肝脏组织HE染色结果
结果如图1显示，空白对照组大鼠肝细胞形态正常，细胞内无脂滴分布，肝索排列整齐，肝窦清晰。模型组大鼠肝细胞明显变大，肝细胞内出现严重的脂肪变性，细胞质内有多数大小不一的脂滴，将细胞核挤向一侧，肝窦变窄，肝索排列不齐。用药4周后，与模型组相比，葱白提取物低、中、高剂量组的大鼠肝细胞内脂肪变性程度逐渐降低，细胞内的脂滴变少变小，特别是葱白提取物高剂量组得到了明显改善。
3.3 肝组织生化检测结果
肝组织生化检测结果显示（见表2），干预实验4周后，与空白对照组相比，模型组大鼠血清中的TC（5.59±0.06）mmol/gprot、TG（2.64±0.03）mmol·gprot-1、MDA（40.40±1.10）mmol·gprot-1水平显著升高，SOD（15.29±0.56）U·mgprot-1及SDH（29.04±1.67）U·mgprot-1水平显著降低（P＜0.05）；
葱白提取物组与辛伐他丁组与模型组相比，高血脂症大鼠血清中的TC、TG及MDA水平下降，SOD与SDH水平升高；
在3个剂量组中，葱白高剂量组的 TC（3.77±0.04）mmol·gprot-1、TG（1.79±0.02）mmol·gprot-1、MDA（20.02±0.13）mmol·gprot-1水平显著降低（P＜0.05），而SOD（52.32±1.14）U·mgprot-1与SDH（90.78±2.18）U·mgprot-1水平显著升高（P＜0.05）。
图2 不同分组的肝细胞组织油红“O”染色
表3 AMPK/mTOR信号通路蛋白在不同组中的表达变化
图3 AMPK/mTOR信号通路蛋白在不同组中的表达变化
3.4 油红“O”染色结果
结果如图2显示，空白对照组肝细胞内细胞核被染色剂染为蓝色，胞质中未见明显橘红色脂滴，肝细胞排列清晰；
模型组细胞明显肿大，胞核蓝染偏向一侧，胞质中出现大量弥漫性红染脂滴，相邻肝细胞脂滴融合，界限模糊。与模型组相比，葱白低、中、高剂量组胞质内脂滴逐渐减少；
与辛伐他丁组相比，葱白高剂量组胞质内脂滴更少。
3.5 葱白提取物对高脂血症大鼠肝脏中AMPK/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平的影响
与空白对照组相比，模型组中mTOR蛋白（0.71±0.02）的磷酸化水平升高，AMPK蛋白（0.27±0.01）与ACC（0.25±0.02）蛋白磷酸化水平降低；
与模型组相比，葱白低、中、高组与辛伐他丁组mTOR蛋白磷酸化水平均下降，AMPK蛋白磷酸化水平升高，且葱白提取物治疗组呈现一定的剂量依赖关系。其中，葱白高剂量组AMPK蛋白（0.53±0.01）与ACC蛋白（0.53±0.01）磷酸化被促进，而mTOR蛋白（0.62±0.02）磷酸化被抑制（见表3和图3）。
高脂血症是影响心血管疾病如动脉粥样硬化和冠心病的关键因素[13]，治疗高脂血症可以为预防心血管疾病提供有效的方法。在临床中，TG、TC、LDL-C和HDL-C是检测高脂血症患者的常用指标。本研究中的大鼠高脂血症模型其血清TG、TC、LDL-C水平显著升高，HDL-C显著降低，且病理组织切片染色结果表明模型组大鼠肝脏细胞发生明显的脂肪变性，证实本实验高脂血症大鼠模型具有可靠性。辛伐他丁作为羟甲基戊二酰辅酶A（Hydroxymethylglutaryl coenzyme A synthase，HMG-COA）还原酶抑制剂，可抑制内源性胆固醇的合成，从而降低血液中的脂质水平达到治疗效果[14]，因此在本研究中使用辛伐他丁作为阳性对照。本研究证实葱白提取物治疗组与辛伐他丁均可降低大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平且升高HDL-C水平，这与冯云霞等[15]采用葱白提取物治疗高脂血症大鼠的结果一致。
祖国医学在治疗高脂血症方面具有独特的优势，能有效降低血脂水平，防止动脉粥样硬化，且药效温和、不良反应少，受到越来越多患者的青睐[16]。已有文献报道葱白提取物具有心脏保护、抗血栓、抗氧化、护肝、抗肿瘤等多种显著的药理作用[17]。超氧化物歧化酶（SOD）是机体内能清除超氧阴离子自由基和保护细胞免受损伤的重要抗氧化酶之一，其水平高低可间接反应机体清除氧自由基的能力。丙二醛（MDA）是自由基作用于脂质发生过氧化反应的氧化产物，其水平高低可间接反应机体脂质氧化情况。本研究中与模型组相比，葱白低、中、高处理组与辛伐他丁组均能降低大鼠血清中的MDA水平，升高SOD水平，且根据本研究推测，随着葱白提取物浓度的增加，其改善血清各项指标的效果越好。Han等[18]研究发现大果榆树提取物可通过激活AMPK途径调节脂质代谢，Cao等[9]在研究青蒿素对小鼠动脉粥样硬化的保护作用机制中表明青蒿素能通过AMPK/mTOR/ULK1途径促进巨噬细胞自噬，从而减轻动脉粥样硬化。这表明在降血脂中药的开发及其作用机制的研究中，关于药物在AMPK/mTOR信号通路中的作用机制成为研究药物机制的重要方向。为进一步探讨葱白提取物发挥降血脂作用的机制，课题组研究了各组大鼠肝脏中的AMPK/mTOR通路蛋白的表达情况，这也是在AMPK/mTOR通路上首次对葱白提取物的作用机制进行探讨。AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是一种通过激活促进脂肪酸氧化和抑制肝脏脂质堆积的丝氨酸/苏氨酸激酶，可通过磷酸化和失活其公认的下游靶标乙酰辅酶A羧化酶（ACC）来调节脂质代谢[19]。在AMPK/mTOR通路中，AMPK的磷酸化通过降低mTOR水平来抑制脂肪形成[20]。Han等[21]在研究红藻素-6-β-龙胆糖苷的降脂作用时，药物治疗组的AMPK磷酸化水平升高，而mTOR磷酸化水平降低，表明该药物可通过调节AMPK/mTOR信号通路来调节大鼠的脂质代谢。本研究模型组大鼠的AMPK磷酸化水平较空白对照组有明显的降低，而mTOR水平则明显升高，经4周治疗后，葱白提取物能明显促进AMPK磷酸化，降低mTOR水平，葱白高剂量组的干预效果与辛伐他丁组的结果相当。类似的，Zhu等[22]表明当AMPK/mTOR通路被抑制时，会减弱药物干预对肝脏脂肪变性的有利作用。因此，我们推测葱白提取物可以通过影响AMPK/mTOR信号通路来调节血脂水平，达到降低血脂的效果。综上所述，葱白提取物能通过调节AMPK与mTOR蛋白磷酸化水平，从而影响AMPK/mTOR信号通路来促进脂肪酸氧化，调节高脂血症大鼠血清中的血脂水平，提示葱白提取物有作为治疗高脂血症药物的潜力，其作用机制有待后续的深入研究。
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