吴翠琴，陈迪云，龚 剑
(1.广州大学环境科学与工程学院，广东 广州 510006；
2.珠江三角洲水质安全与保护教育部重点实验室，广东 广州 510006；
3.广东省放射性核素污染控制与资源化重点实验室，广东 广州 510006)
苯胺类物质作为重要的化工原料和中间产物，广泛应用于染料、橡胶、制药、塑料、农药、油漆等行业[1]。苯胺类物质具有很高的毒性，少量即可中毒，会引起溶血性贫血，导致肝损害造成中毒性肝病，其中一些还有明显的致癌、致畸、致突变的“三致”作用[2]。中国、美国和欧盟等均将其列入常规监测和优先监测的污染物名单[3]。由于苯胺及硝基苯胺类物质的极性较强，在水中的溶解度较高，易进入环境水体中，因此，建立简便、灵敏和准确的方法用于测定水体中的苯胺类物质，显得尤其重要。
液液萃取-高效液相色谱法常用于苯胺类物质的测定。胡君梅[4]采用此方法测定了硝基苯胺类物质，但是该方法没有测定检出限，只是做了线性范围。在《水和废水监测分析方法》(第4版)（增补版）中关于苯胺类物质的测定，也是采用液液萃取-高校液相色谱法[5]，但是该方法实际操作起来存在一些困难。因此，本文对实验条件进行优化，建立了更为简便和灵敏的测定水体中苯胺类物质的方法。
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（配备二极管阵列检测器DAD），旋转蒸发仪，超声波清洗机，溶剂过滤器，水性滤膜（0.45μm），针式过滤器（0.45μm）。
苯胺、对硝基苯胺的甲醇标准储备液（1000.0 μg・mL-1），邻硝基苯胺（纯度≥ 99.0%），2, 4-二硝基苯胺（纯度≥99.0%），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯）。其他试剂均为分析纯。
1.2 样品的处理
水样用1 mol・L-1氢氧化钠溶液调节pH至11~12，取其中100mL放入含有5g氯化钠（避免乳化现象）的250mL分液漏斗中，振摇，将氯化钠完全溶解。用8mL二氯甲烷萃取2min，放气，静置10min。将萃取后的有机相用无水硫酸钠脱水后，收集于鸡心瓶，重复萃取2次，合并有机相，用旋转蒸发仪将萃取液浓缩至1mL左右，加入2 mL甲醇继续旋转蒸发浓缩至约0.5mL，用甲醇定容至1 mL，用0.45 μm滤膜过滤，待色谱分析。
1.3 色谱的测定条件
色 谱 柱：Agilent Extend-C18，5μm，250mm ×4.6mm；
流动相：乙腈和蒸馏水，梯度洗脱条件见表1，流速：1.0 mL・min-1；
检测波长：230 nm；
进样量：10 μL。
表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions
2.1 色谱条件
2.1.1 检测波长及流动相的选择
苯胺类物质的结构中有1个苯环，有较强的紫外吸收，可直接用紫外检测器进行检测。《水和废水监测分析方法》中，测定苯胺类物质时，采用285 nm作为检测波长。我们在210~400 nm波长范围内对4种苯胺类物质进行扫描（图1），发现对硝基苯胺和2, 4-二硝基苯胺在285nm几乎没有吸收，但在230nm处，4种物质都有一个较强的吸收峰，因此本实验选择230 nm作为检测波长。
图1 苯胺类物质的紫外吸收曲线Fig.1 UV absorption curve of anilines
分别考察了2种流动相体系对4种苯胺类物质的分离效果：1）甲醇-0.05 mol・L-1乙酸铵-乙酸缓冲溶液；
2）乙腈-水溶液。对色谱分离条件进行优化后，这2种流动相体系都能使4种目标物得到很好的分离，但是采用甲醇-0.05mol・L-1乙酸铵-乙酸缓冲溶液体系作为流动相时，色谱基线不稳，且使用缓冲液作为流动相，实验结束后，冲洗色谱柱会比较耗时，因此本实验选择乙腈-水溶液作为流动相。
2.1.2 进样体积
分别考察了3个进样体积15μL、10μL、5μL，发现进样为15μL时会使色谱峰前延。为了达到更好的灵敏度并获得对称性良好的峰形，本实验选择进样体积为 10μL。
2.2 样品的预处理
2.2.1 萃取溶剂的选择
苯胺类物质是极性较强的化合物，为了能够有效地萃取水中的苯胺类物质，而不把其它极性的物质萃取出来，我们以中等极性的乙醚和二氯甲烷作为萃取溶剂进行了实验，发现两者对苯胺类物质都有较好的萃取效率，但乙醚极易挥发且有麻醉作用，因此，本实验采用二氯甲烷作为萃取剂。
2.2.2 静置时间的选择
本实验发现，用分液漏斗进行液液萃取后，分离出有机相之前的静置时间，对苯胺类物质的萃取率有影响。有文献报道，可静置30min以实现有机相和水相的完全分离。为此，本实验分别考察了静置时间分别为 5min、10min、15min、30min 时，苯胺类物质的萃取率。结果发现，静置10min，苯胺类物质的萃取率最高，静置5min时萃取率偏低，原因可能是有机相和水相没有达到完全的分离。静置时间过长（15min、30min），萃取率反而有所降低，可能是苯胺类物质的不稳定性质所致，同时耗时较长，因此本实验选择静置时间为10min。
2.2.3 浓缩方法的选择
氮气吹干和旋转蒸发是浓缩样品常用的方法。本实验采用氮吹仪进行浓缩，发现比较耗时；
采用旋转蒸发仪进行浓缩，快速且回收率能够满足要求，故本实验采用旋转蒸发仪进行样品的浓缩，以提高实验效率。
用旋转蒸发仪将萃取液浓缩至0.5mL左右，再用甲醇定容至1mL进行色谱分析，发现在2, 4-二硝基苯胺的出峰处出现了一个很大的包状峰。考虑到二氯甲烷、甲醇、乙腈极性的差异，尝试将萃取液浓缩至少量体积后，加入甲醇再继续浓缩，发现包状峰形消失。最终确定先将萃取液浓缩至1 mL左右，加入2 mL甲醇再继续旋转蒸发至约0.5 mL，用甲醇定容至1 mL，待色谱分析。
2.3 方法的线性范围和检出限
考察了苯胺类物质在0.05~10.00 μg・mL-1浓度范围内的线性关系，每个浓度重复测定3次，结果见表2。从表2可知，4种苯胺类物质的线性相关系数r为0.9989~0.9992。以3倍信噪比（S/N）得出方法的检出限为0.05~0.1 μg・L-1，可以满足对水体中4种苯胺类物质的检测分析要求。
表2 4种苯胺类物质的标准曲线回归方程和检出限Table 2 The standard curve regression equations and detection limits of four anilines
2.4 样品分析
用棕色瓶从广州某印染厂采集废水样，低温运输，在24h内按上述方法进行预处理后上机测样，谱图见图2。测得废水中含有 1.07μg・L-1的苯胺及0.72 μg・L-1的邻硝基苯胺。
图2 样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of Sample
2.5 方法的添加回收率和精密度
在印染废水样品中添加4种苯胺类物质的混合标准溶液，使其浓度为10μg・L-1，按照本方法的操作步骤进行回收率实验，平行操作6次，扣除样品空白后，计算回收率和精密度，实验结果见表3。从表3可知，印染废水中的苯胺类物质的平均回收率为85.8%~95.8%，相对标准偏差为3.8%~7.2%，说明本方法较准确，重现性好，符合检测要求。
表3 印染废水中苯胺类物质的回收率和精密度Table 3 Recoveries and their precisions of the anilines spiked in dye waste water (n=6)
本文对水体中的苯胺类物质进行分析及研究，确定了采用高效液相色谱法测定水体中4种苯胺类物质的色谱分析条件和萃取条件。先采用传统的液-液萃取法，以二氯甲烷为萃取剂萃取水中的苯胺类物质，经旋转蒸发仪浓缩后，再采用反相高效液相色谱法，以乙腈-水为流动相，在230 nm波长处进行检测。苯胺、对硝基苯胺、邻硝基苯胺和2, 4-二硝基苯胺均实现了良好的分离。样品的加标回收率为85.8%~95.8%，相对标准偏差小于8%，方法的检出限为0.05~0.1 μg・L-1，明显低于《水和废水监测分析方法》(第4版)（增补版）中苯胺类物质的检出限（0.3~1.3 μg・L-1）。另外，本方法萃取后未经硅酸镁层析柱净化，也能得到满意的回收率和理想的色谱图，说明本方法简便、快速、准确，适用于水体中苯胺类物质的测定。
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