李敏,魏春秀，杨武杰，王芳,赵静
(1.菏泽学院农业与生物工程学院微生物重点实验室,山东 菏泽 274015; 2.滨州市农业综合执法支队, 山东 滨州256600;3.山东省农业技术推广中心,山东 济南 250014; 4.山东省聊城市莘县农业农村局, 山东 聊城 252400;5.中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室, 北京 100101)
观赏牡丹(PaeoniasuffruticosaAndrews)，属于芍药科芍药属，为落叶小灌木，是一种具有观赏性、食用性和药用性的植物，广泛应用于消炎、降血糖、抗肿瘤等方面的治疗.牡丹的栽培历史悠久，种植地分布广泛.随着种植年限增加，地下某些微生物逐年累积，致使牡丹根部腐烂，造成了油用牡丹的大量减产和观赏牡丹的大面积死亡，牡丹种植业无法持续和延伸[1].牡丹根腐病又称烂根病，是最严重的土传病害之一，研究表明在山东菏泽牡丹根腐病的发病率约20%，严重地块可达到40%以上[2].孙文姬[1]、成玉梅[3]等认为引起菏泽地区牡丹根腐病的病原菌主要是茄病镰刀菌.茄病镰刀菌属于瘤座孢科、镰孢霉属，营寄生或腐生生存，而吴玉柱[4]等则认为茄腐皮镰孢霉是引起牡丹根腐病的病原菌.这些病原菌使牡丹根部腐烂，叶片失绿萎靡，植株生长缓慢，严重时导致植株枯萎死亡[5]，根腐病导致牡丹种植业经济亏损严重，并且影响丹皮的产量及药用价值[6].由此可见，影响牡丹根腐病的病原菌可能不止一种，有可能是多种病原菌相互作用的结果.目前控制牡丹根腐病的主要措施是采用农业和化学防治[7-8]，但成效甚微.传统农业防治虽然低能耗、低污染，但成本高，费时费力，且见效慢；
化学防治虽在短时间内经济有效，但长期使用易产生抗药性，造成农药残留、人畜中毒，影响生态平衡，使生物多样性遭到破坏.新兰[9]在辣椒疫病、李海薇[10]等在棉花枯萎病、王瑶[11]等在禾谷镰刀菌、Weindling[12]等在大豆炭腐病的防治中均采用生物防治，并取得良好效果，生物防治有利于可持续发展.目前生物防治在其他植物根腐病方面有了一定进展，张建强[13]等从无病燕麦根际土壤中分离筛选得到一株对燕麦镰孢菌高效拮抗的细菌，细菌对供试病原菌表现出较好的抑菌作用.许乐[14]等从无病丹参根际土壤和植株中分离筛选得到一株高效抑制丹参病原菌生长的菌株，该菌株的粗提物对病原菌具有较强的抑制效果.牡丹的生防菌也有相关研究，王雪山[15]等从6份牡丹根际土壤样品中分离得到7株对牡丹根腐病原菌具有良好拮抗作用的细菌分离物，其抑菌带宽度在2～5 mm之间，具有较好的抑菌效果.吴玉柱[8]等从无病牡丹根际土壤中分离筛选得到6株抑菌效果较好的菌株.孟国庆[16]等从牡丹根际土壤中分离筛选出2株具有抑制效果的菌株，并鉴定为芽孢杆菌属，这说明生物防治目前在牡丹病菌防治方面是可行的.由于引起牡丹根腐病的病原菌种类不一定是一种，本研究针对曹州牡丹园精品园区的部分观赏牡丹烂根进行病原菌分离，分离健康牡丹根际土壤和植株内的细菌，通过平板对峙实验[17]，旨在筛选高效抑制牡丹病原菌的生防菌，为探讨生防菌抗性机理，生物农药和生物肥料的研发提供理论支持.
1.1 材料
1.1.1 供试土壤和植株
发病牡丹植株，无病牡丹植株和牡丹根际土壤由曹州牡丹园提供.
1.1.2 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基、PDA、查氏培养基、生理生化培养基等[18-19].
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离、纯化与保藏
将从曹州牡丹园取的发病牡丹植株的根部置于无菌袋中，带回微生物实验室，冲洗表面的泥土和污物，将病根剪成1～2 cm小段或方块置于0.1%汞溶液中处理15 min，并用无菌水冲洗3次，再置于75%乙醇溶液中处理30 min，用无菌水冲洗3次，无菌条件下接种于PDA平板上，置于26 ℃下培养，第2 d开始观察，待病根上长出菌丝，对其进行分离、纯化，菌落形态特征、显微形态特征，保藏，以备后续实验使用[20].
1.2.2 生防菌的分离、纯化与保藏
取无病牡丹植株及其根际土壤，从无病植株分离生防菌的方法同病原菌；
土壤中微生物的分离步骤如下：25 g根际土壤置于225 mL无菌生理盐水中，制成浓度为10-1g/mL的溶液，吸取1 mL置于盛有9 mL生理盐水的试管内，稀释成10-2g/mL，采用同样方式稀释至10-6g/mL，吸取适宜稀释梯度溶液100 mL涂布营养琼脂平板上，次日观察并及时挑取细菌，采用三区划线法对菌落进行分离、纯化和保藏，以备后续实验使用.
1.2.3 抑菌判断标准
(1)不抑制：病原菌生长并覆盖细菌.
(2)一般抑制：病原菌生长迟缓，病原菌与生防菌之间有抑菌圈，且二者之间的距离小于1 cm，不能覆盖细菌.
(3)较强抑制：病原菌生长基本停止，无法向外延伸，病原菌与生防菌之间有明显抑菌圈，且二者之间的距离大于1 cm，不能覆盖细菌.
1.2.4 生防菌的筛选
采用对峙实验筛选生防菌，将活化病原菌接种在查氏平板中，26 ℃下倒置培养2 d，菌落长到约2 cm时，将活化的细菌点接种在病原菌水平和垂直线上距菌落3 cm处的位置，26 ℃下倒置培养观察，根据抑菌的标准判断抑菌能力大小.
1.2.5 提取液的制备与抑菌筛选
将筛选的生防菌活化，制成1012个/mL的菌悬液，在无菌条件下吸取1 mL，接种在装有150 mL LB液体培养基的三角瓶中，在37 ℃，转速为300 r/min的条件下培养24 h，制成发酵提取液.将6 mol/L HCl加入发酵液中，调节pH至2.0，在4 ℃条件下静置过夜，10 000 r/min离心20 min，除去上清液，加入3 mL pH为7.2的甲醇搅匀，在4 ℃条件下静置8 h，在10 000 r/min离心10 min，取其上清液转移到新的无菌离心管中，即为胞外粗提物，用0.22 μm的滤膜过滤除菌，无菌条件下吸取100 μL粗提取物置于无菌滤纸片(直径为6 mm)上，操作方法同生防菌的筛选.
1.2.6 生防菌的形态学观察和生理生化实验
观察抑制能力强的生防菌的菌落形态特征，显微形态特征；
对其进行生理生化实验(甲基红实验、糖发酵实验、淀粉水解实验等)了解其理化特性[21].
2.1 病原菌的分离、观察
从牡丹病株的根部分离纯化得到2株病原菌，命名为MDG1和 MDG2(见图1).牡丹病原菌MDG1菌落呈青绿色，边缘整齐呈白色，中间厚边缘薄.主菌丝比较粗，分枝菌丝细且尖端比较圆润，孢子形状不规则.牡丹病原菌MDG2菌落呈絮状，边缘整齐呈白色，中间厚边缘薄.菌丝特征与MDG1相同，但MDG2孢子形状呈梭形，生长到一定阶段脱落.
图1 牡丹根腐病病原菌MDG1、MDG2的菌落、显微形态分析图
2.2 生防菌的抑菌效果
2.2.1 病原菌MDG1生防菌的筛选
由图2可知，细菌G22、t12对病原菌MDG1的抑制能力较强，使得病原菌丝变纤细，显著阻止病原菌的生长，病原菌与生防菌之间的距离大于1 cm；
细菌GX4、18、38对病原菌MDG1的抑制能力一般，能使病原菌变纤细，但抑制能力不强，有轻微接触，病原菌与生防菌之间的距离小于1 cm，病原菌仍能生长繁殖；
细菌44、17、12通过快速生长繁殖，以挤占病原菌的生长空间的方式对病原菌MDG1进行抑制，能使病原菌变纤细，但抑制能力一般，病原菌与生防菌之间的距离小于1 cm，生长速度缓慢但仍能继续生长.
图2 病原菌MDGI的对峙实验图
2.2.2 病原菌MDG2生防菌的筛选
由图3可知，细菌37、32对病原菌MDG2的抑制能力较强，使得病原菌变纤细，无法向外扩展，能够显著阻止病原菌的生长，病原菌与生防菌之间的距离大于1 cm；
细菌G42对病原菌MDG2的抑制能力一般抑制，能使病原菌变纤细，但抑制能力不强，有轻微接触，病原菌与生防菌之间的距离小于1 cm，病原菌仍能生长繁殖；
细菌9、41、45、40、WX9通过快速生长繁殖，以挤占病原菌生长空间的方式对病原菌MDG2进行抑制，使病原菌变纤细，但抑制能力不强，有轻微接触，病原菌与生防菌之间的距离小于1 cm，病原菌生长缓慢但仍能继续生长至与生防菌接触.细菌G22、G23、WX8释放的代谢物对病原菌MDG2进行抑制，能使病原菌变纤细，无法向外扩展，能够显著阻止病原菌的生长，病原菌与生防菌之间的距离大于1 cm.
图3 病原菌MDG2的对峙实验图
2.3 生防菌提取液的抑菌效果
2.3.1 病原菌MDG1的生防菌发酵液的筛选
图4 病原菌MDG1的液体抑制图
由图4可知，WX3、32的发酵液对病原菌MDG1的抑制能力较强，能使病原菌变纤细，无法向外扩展，病原菌生长不能覆盖滤纸片，病原菌与滤纸片之间有明显的抑菌圈，说明发酵液中某种或多种成分具有抑菌作用.
图5 病原菌MDG2的液体抑制图
2.3.2 病原菌MDG2的生防菌发酵液的筛选
由图5可知，G49、WX8的发酵液对病原菌MDG2的抑制能力较强，使病原菌变纤细，无法向外扩展，病原菌生长不能覆盖滤纸片，病原菌与滤纸片之间有明显的抑菌圈，说明发酵液中具有一种或多种抑菌成分，WX8的发酵液中含抑菌成分或种类较少，生长后期不具有抑制功能.
2.4 生防菌的分离、纯化与形态学观察
2.4.1 生防菌的分离、纯化
由图6可知，G22为较小的淡黄色圆形菌落，表面湿润有光泽，44、WX8、40、41、WX9、t12这6株生防菌表面干燥有褶皱，边缘不平整呈锯齿状，菌落较大，无突起.其中t12、44、40、WX9、41呈淡黄色，WX8较其颜色略淡，呈乳白色.18、G42这2株为淡黄色不规则形菌落，表面干燥有褶皱，边缘不整齐呈锯齿状.G49、9、45这3株生防菌菌落较大，呈淡黄色，表面湿润，且有光泽.G23、32这2株生防菌菌落较大，呈白色，形状不规则，表面湿润，且不光滑有褶皱，边缘不整齐呈锯齿状.WX3菌落较小，呈白色，圆形，表面湿润，且有光泽.
图6 生防菌菌落图
图7 革兰氏染色图片
2.4.2 生防菌的形态学观察
通过革兰氏染色观察发现，如图7所示，G22近似球形或椭圆形，为革兰氏阴性菌；
G49近似球形或椭圆形，为革兰氏阳性菌；
12、WX3、t12、17、44、38、GX4、18、32、G42、38、40、9、45、WX9、WX8、37这17株生防菌近似杆状或棒状，菌体大多平直细长，两端圆润或尖锐，为革兰氏阳性菌，41、G23这2株近似短杆状，两端尖锐，为革兰氏阴性菌.
表1 生防菌的生理生化结果
2.5 生防菌生理生化实验鉴定
由表1可知，抑制观赏牡丹病原菌的生防菌共21株，生防菌均能分解明胶呈阳性；
G22能够利用乳糖产酸变黄，乳糖发酵呈阳性；
GX4、WX8、40、G23这4株生防菌不能利用葡萄糖产酸产气为阴性，其余生防菌均为阳性；
38、WX8、9、32这4株生防菌不能分解淀粉呈阴性，其余生防菌均为阳性；
G22、18、12、32、G23、G49这6株生防菌滴加甲基红试剂使培养基变黄为阴性，其余生防菌均为阳性；
18、t12、38、37、43、WX8、45、G42、WX9这9株生防菌使培养基变成深蓝色，说明这9株生防菌能够利用柠檬酸盐生长，使pH变为碱性且颜色变化为阳性，其余生防菌均为阴性；
GX4、18、44、17、12、t12、38、41、WX3、45、32、40、G23、G49这14株生防菌滴加吲哚试剂后呈粉红色，说明这14株生防菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，与吲哚试剂内的对二甲基氨基苯甲醛作用形成红色为阳性，其余为阴性.
(1)本实验通过菌落形态，显微形态观察，初步确定引起曹州牡丹园牡丹根部腐烂的病原菌为MDG1、MDG2.
(2)从无病牡丹土壤和植株内分离、纯化细菌136株，以牡丹根腐病病原菌为靶目标，分离到21株具有较强抑菌能力的细菌，对病原菌MDG1抑制能力较强的有8株细菌(G22、GX4、18、44、17、12、t12、38)和32、WX32株菌株发酵液；
对病原菌MDG2抑制能力较强的有11株细菌(37、41、WX8、G22、9、45、G42、32、40、G23、WX9)和G49、WX82株菌株发酵液，G22对于两种病原菌都有抑制作用，WX8的菌体和发酵液对于病原菌MDG2都有抑制作用.
对抑制性强的生防菌进行形态学观察和生理生化实验，为探究生防菌及其代谢物对牡丹病原菌抑制机理提供理论基础，为开发生物菌肥提供理论支撑.
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