王超 姜鑫 矫筱蔓 陈权
【关键词】UPLC-MS/MS；
中药制剂；
非法添加；
抗组胺类药物
中药凝聚了中华民族数千年的智慧，在我国有着悠久的历史，深受患者的青睐[1-2]。近年来，一些不法商家为了谋求利益，在中药制剂中非法添加化学药品的情况时有发生[3-4]。这可能导致患者出现严重的不良反应，甚至可能会危害到患者的健康和生命安全[5-6]。因此，国家药品监督管理总局颁布了一系列针对非法添加的补充检验方法。目前，已报道的抗组胺类药物的检测方法多为液相色谱法[7-9]和液质联用法[10]，但超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS）法以其专属性强、灵敏度高等优点广泛应用于中药制剂中非法添加的检测[11-15]。本文选取13 种常用的抗组胺类药物，采用UPLC-MS/MS法建立中药制剂中非法添加的抗组胺类药物的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
曲吡那敏、溴苯那敏来自LGC公司，氯苯那敏、苯海拉明、地氯雷他定、异丙嗪、阿司咪唑、赛庚啶、羟嗪、西替利嗪、氯丙嗪、特非那定、氯雷他定来自中国食品药品检定研究院。
甲醇为色谱纯；
甲酸、甲酸铵均为质谱级；
水为超纯水。中药制剂样品均为市售样品。
1.2 仪器与设备
XEVO TQ超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱联用仪（美国Waters 公司）；
XPE205DR电子天平（梅特勒-托尼多仪器有限公司）；
Milli -Q Advantage A10 超纯水仪（美国Millipore 公司）；
AS3120A超声清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 色谱条件
Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×150mm，1.7 μm）；
柱温：35 ℃；
流动相A 为10 mmol/L 甲酸铵-0.1%甲酸水溶液，流动相B 为甲醇，梯度洗脱（0～2 min，45%B；
2～8 min，45%～60% B；
8～12.5 min，60%～75% B；
12.5～13min，75% B～95% B；
13～16 min，95% B；
16.5～20 min，45% B）；
进样体积：1 μL。
1.3.2 质谱条件
离子源：电喷雾离子（ESI）源；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测（MRM），毛细管电压：4.0 kV；
脱溶剂气温度：400 ℃；
脱溶剂气流速：800 L/Hr；
锥孔气流速：50 L/Hr；
碰撞气流速：0.15 mL/min。
1.3.3 对照品储备液的制备
精密称取各对照品约10 mg，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成質量浓度约为1 mg/mL的对照品储备液。分别精密吸取各对照品储备液适量，用甲醇稀释，配制成1 μg/mL的混合对照品溶液。
1.3.4 供试品溶液的制备
取样品约1 g，精密称定，置50 mL 量瓶中，加入甲醇45mL，超声提取10 min，放冷至室温，加甲醇定容至刻度，混合摇匀，经0.22 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
分别考察水、0.1%甲酸水及10 mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸三种水溶液作为水相的分离效果。结果发现：水相为纯水时，部分色谱峰峰型较宽，拖尾严重；
当体系中加入酸时，可增加各组分的响应，峰型也得到了一定的改善，但部分组分保留时间过短；
使用甲酸铵-甲酸体系作为水相，可明显抑制拖尾现象，且保留时间合适。分别考察甲醇和乙腈两种溶剂作为有机相的分离效果，结果表明两种溶剂的分离效果相差不大，考虑到供试品溶液的提取溶剂为甲醇，故采用10 mmol/L 甲酸铵-0.1%甲酸水溶液和甲醇作为流动相。
2.2 质谱条件的优化
采用100 ng/mL的混合对照品溶液以流动注射的方式进行质谱条件的优化。正离子模式下采用一级质谱扫描方式进行母离子扫描，确定各组分的准分子离子峰，并对锥孔电压进行优化；
对待测物的分子离子进行子离子全扫描，并对碰撞能量进行优化，选取丰度最强的碎片离子作为定量离子，次强的碎片离子作为定性离子，不同组分质谱分析条件见表1。
2.3 样品前处理的选择
试验通过比较不同的提取溶剂（甲醇、乙腈），不同溶剂质量分数（50%、75%、100%）以及不同超声时间（5 min、10 min、15 min）对加标样品的提取效率进行考察。结果表明，超声时间延长对提取效率的影响不大，但随着提取溶剂中有机相比例减少，提取效率稍有降低；
甲醇和乙腈的提取效率相差不大，由于对照品是用甲醇溶解，故选择甲醇作为提取溶剂超声10 min。
2.4 方法学考察
2.4.1 专属性试验
取混合对照品溶液（10 ng/mL）按“1.3.1”和“1.3.2”项下的色谱条件和质谱条件进样、测定，色谱图见图1。取不含任何化学成分的中药制剂按“1.3.4”项的方法处理并测定，阴性样品色谱图上均无干扰。
2.4.2 标准曲线及线性范围
用甲醇将混合对照品溶液稀释成一系列质量浓度（ng/mL）分别为2、5、10、20、50 的线性溶液，进样分析，以浓度为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果表明，各组分在其线性范围内，质量浓度与峰面积均有良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.999，见表2。
2.4.3 检出限和定量限
取混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释后进样分析，按信噪比为3（S/N=3）计算检出限（LOD），按信噪比为10（S/N=10）计算检定量限（LOQ），结果见表2。
2.4.4 加标回收试验
以不含任何化学成分的中药制剂为基质，采用3 个质量浓度（2.5、5、25 ng/mL）添加混合对照品溶液，按“1.3.4”项下方法处理并测定，计算不同组分的加标回收率，结果表明，各组分的加标回收率在91.1%～101.3%之间，RSD均小于5%，见表3。
2.4.5 精密度试验
取混合对照品溶液（10 ng/mL），连续进样6 次，计算峰面积的RSD，结果表明，各组分的精密度RSD均小于2.5%，见表3，说明仪器具有较好的精密度。
2.4.6 稳定性试验
取加标回收试验样品溶液（5 ng/mL），在配制后分别放置0、2、4、8、12、24 h，进样测定，计算各组分含量的RSD，结果表明，各组分的稳定性RSD均小于5%，见表3，说明供试品溶液在24 h 内稳定。
2.4.7 样品测定
按拟定的含量测定方法，对10 批市售中药制剂进行测定，均未检出上述组分。
3 结论
本研究基于UPLC-MS/MS技术，建立了13 种抗组胺类组分的定性、定量分析方法。所建方法前处理方法简单、准确、灵敏，专属性强，分析时间短，可用于中药制剂中非法添加抗组胺类组分的检测，可为药品监管部门提供技术支撑。
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