马发顺，岳超，元雪浈，张大斌，梁秀丽
（1.安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000；
2.河南省兽用生物制品研发与应用国际联合实验室，安阳 455000；
3.河南省兽药饲料监察所，郑州 450000）
黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是从黄芪的根系及茎秆中分离提取的具有生物活性的水溶性杂多糖[1]。APS可有效促进雏鸡免疫器官发育，提高血液中免疫球蛋白含量和T淋巴细胞数量[2]。APS不仅可增强断奶羔羊免疫球蛋白水平，还可提高其抗病能力[3]。APS是一种免疫增强剂，在猪的免疫功能中起着重要作用，还可提高仔猪的日增重和料重比[4-5]。APS可以促进禽类法氏囊和脾脏更好地发育，提高免疫功能指数[6]。APS不仅能促进肉鸡的生长发育，还能抑制肠道病原菌生长，促进益生菌增殖[7]。目前关于APS生物活性检测方面的报道较少，仅元雪浈等对APS生物活性检测方法进行了分析和评价并建立了检测模型，对APS生物活性检测中各因子之间的关系也只作了典型相关分析[8-10]，还没有关于这些因子之间回归分析的报道。本试验采用《中华人民共和国兽药典2015版（二部）》提供的APS生物活性检测方法，对试验过程中的各个因子进行简单相关分析和典型相关分析，在此基础上进行回归分析，以了解各因子之间的内在联系，定量描述部分因子之间的关系，为进一步改进APS生物活性检测方法提供参考依据。
1.1 材料
1.1.1 试验动物
昆明鼠（SPF级，许可证号：SCXK2016-0002）40只，雌雄各20只，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。使用IVC-Ⅱ型独立送风隔离笼具饲养，设定温度20～26℃，湿度60%，供给足量饲料，自由采食和饮水；
饲料和饮水均经高温灭菌，紫外线照射消毒。
1.1.2 仪器和试剂
电子天平（型号ES3200），天津市德安特传感技术有限公司生产；
梅特勒分析天平（型号XS205DU），上海双旭电子有限公司生产；
独立送风隔离笼具（型号IVC-Ⅱ），苏州市冯氏实验动物设备有限公司生产；
一次性使用无菌注射器（规格1 mL），圣光医用制品有限公司生产。APS注射液[以葡萄糖（C6H12O6）计10mL：0.1g]，由河南省某兽药厂提供；
0.9%氯化钠注射液（规格250 mL，国药准字H3702070766），购自山东齐都药业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
将昆明鼠按照饲养标准适应性喂养2d后，称取小鼠始重。取体重18～20 g的健康小鼠40只，按性别分为2组，每组20只；
再把雌、雄小鼠分别随机分为2组，每组10只；
随机设为试验组和对照组。试验组每只小鼠腹腔注射APS注射液0.5 mL/d，对照组每只小鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL/d，连续注射7 d；
于最后一次注射24 h后将小鼠颈椎脱臼处死；
称取每只小鼠的体重、脾脏重、胸腺重，并计算脾指数和胸腺指数等。
1.2.2 因子的测定
把APS生物活性检测中的因子分为两类。第一类3个初始因子：处理方式（x1）：注射APS注射液赋值为“1”，注射生理盐水赋值为“0”；
性别（x2）：雄性赋值为“1”，雌性赋值为“0”；
始重（x3）：试验开始时的体重（g）。第二类5个效应因子：脾脏重（x4）：试验结束时摘取脾脏称重（mg）；
胸腺重（x5）：试验结束时摘取胸腺称重（mg）；
末重（x6）：试验结束时的体重（g）；
脾指数（x7）：计算方法x4/x6；
胸腺指数（x8）：计算方法x5/x6。
1.2.3 统计处理
对原始数据按性别和处理方式进行整理，计算出各因子的平均值、标准差和变异系数，数据以“平均数±标准差”表示。在同性别的试验组与对照组之间进行各因子的差异性t检验，接着进行8个因子间的简单相关分析，然后对两类因子进行典型相关分析，在此基础上进行多元逐步回归分析，建立回归方程。使用Excel 2010软件整理数据并进行差异显著性检验；
使用DPS v7.05软件进行简单相关分析、典型相关分析和逐步回归分析。
2.1 试验因子表现
对试验原始结果按性别和处理分组汇总。各因子的描述统计结果见表1。
表1 APS生物活性检测中各因子的描述统计
从表1可以看出，试验组与对照组比较，x3雌性组和雄性组均差异不显著（P＞0.05）；
x4雌性组差异显著（P＜0.05），雄性组差异极显著（P＜0.01）；
x7雌性组和雄性组均差异极显著（P＜0.01）；
x5、x6、x8雌性组和雄性组均差异不显著（P＞0.05）。从变异程度看，x4、x5、x8变异程度较大，x3、x6、x7变异程度相对较小。
2.2 各因子间的简单相关关系
8个因子间简单相关系数见表2。
表2 8个因子之间的简单相关系数
从表2可以看出，3个初始因子间的相关关系均不显著（P＞0.05）；
5个效应因子间，x4与x6、x7间均具有极显著的相关关系（P＜0.01），x5与x8间具有极显著的相关关系（P＜0.01），其余相关系数不显著（P＞0.05）；
3个初始因子与5个效应因子间，x4与x1、x2间，x6与x2间，x7与x1间均具有极显著相关关系（P＜0.01）。
2.3 典型相关分析
3个初始因子（x1、x2、x3）与5个效应因子（x4、x5、x6、x7、x8）之间的典型相关分析结果见表3。
表3 典型相关系数及其显著性
从表3可知，前2个典型相关系数达到了极显著水平（P＜0.01），第3个不显著（P＞0.05）。可见，初始因子和效应因子间的相关性主要由前2对典型变量所解释。各因子的变异被2对达到极显著水平的典型变量所解释的比例见表4。
表4 各因子的变异能被2对典型变量解释的比例
从表4可以看出，第1对典型变量U1、V1对初始因子可解释的比例分别为36.90%、30.82%，对效应因子可解释的比例分别为21.86%、27.06%，第2对典型变量U2、V2对初始因子可解释的比例分别为33.20%、21.79%，对效应因子可解释的比例分别为21.58%、33.70%。
2对典型变量的线性结构式为：U1=-0.2378x1+0.8971x2+0.1826x3，V1=-0.1551x4-0.1341x5+1.1445x6-0.0498x7+0.0956x8；
U2=-0.9642x1-0.2034x2-0.0983x3，V2=-1.2943x4+0.2562x5+0.5701x6+0.0154x7-0.0895x8。从线性结构式中各项系数绝对值的大小来看，U1中x2系数最大，其次是x1；
V1中x6系数最大，其次是x4；
U2中x1系数最大，其次是x2；
V2中x4系数最大，其次是x6。说明初始因子与效应因子之间的相关关系主要是由x1、x2和x4、x6之间的密切关系所造成。
2.4 因子间的回归方程
因为脾指数（x7）是判定APS样品是否合格的重要指标，所以选择x7作为因变量。因x7与x1、x4间均有极显著正相关关系（P＜0.01），与x2、x6间也有正相关关系（P＞0.05）；
x7的变异主要被第2对典型变量（U2、V2）所解释，此对典型变量主要反映x1、x2与x4、x6间的关系，而x1与x4间，x2与x4、x6间，以及x4与x6间均具有极显著正相关关系（P＜0.01），所以，可把x1、x2、x4、x6纳入自变量范畴，按试验组和对照组分别建立回归方程。
试验组因子间的回归方程为x7=6.176-0.068 x2+0.037 x4-0.230 x6（R2为0.992 6），对照组因子间的回归方程为x7=3.902-0.052 x2+0.034 x4-0.134 x6（R2为0.992 1）。两个回归方程中各自变量对因变量的偏相关系数和通径系数见表5。
表5 回归方程中的偏相关系数和通径系数
从表5可知，两个回归方程中x4、x6的偏相关系数均达到极显著水平（P＜0.01），并且x4与x7之间呈正相关关系，x6与x7之间呈负相关关系。通径分析表明x4对x7的决定作用最强。
从APS生物活性检测中各因子的表现来看，小鼠的始重符合试验基本要求，并且试验组与对照组随机安排效果良好。脾脏重（x4）试验组显著（雌性，P＜0.05）或极显著（雄性，P＜0.01）高于对照组，脾指数（x7）试验组极显著高于对照组（雌性和雄性，P＜0.01），说明APS对小鼠脾脏重（x4）和脾指数（x7）均有显著作用（P＜0.05），而对胸腺重（x5）及胸腺指数（x8）无显著作用（P＞0.05），此表现与元雪浈等[10]的研究结果相似。脾脏重（x4）、胸腺重（x5）和胸腺指数（x8）均存在较大的个体差异，可能是不同个体对APS的感应度有所不同。现行APS生物活性检测方法中仅规定试验组平均脾指数与对照组平均脾指数之差大于等于2判定样品合格，否则判定为不合格；
既没有关于试验动物性别因素的限制，又没有考虑试验误差的影响。若能使用统计学方法进行差异显著性检验并运用到试验结果的判断中，将会提高试验结果的科学性与判断的可靠性。
从8个因子间的简单相关系数来看，3个初始因子间的相关系数均不显著（P＞0.05），说明试验设计时严格遵守了随机原则，试验动物的初始条件控制良好。x4与x6、x7间极显著的相关关系，与元雪浈等[10]的研究结果一致，充分说明以脾指数作为APS生物活性检测指标的合理性。x4与x1、x2间的极显著相关关系说明试验处理和性别对脾脏重均有极显著影响，这不仅进一步证实了APS对脾脏生长的促进作用，而且还揭示出在试验中应考虑小鼠性别因素的必要性[8，10]。x1与x7之间极显著的相关关系（P＜0.01）对现行APS生物活性检测方法具有有效支持，解决了元雪浈等[10]在讨论中提出的问题。尽管x5与x8间具有极显著正相关关系（P＜0.01），但x4和x5间、x7和x8间相关系数均不显著（P＞0.05），所以，x8在APS生物活性检测时的作用不大。
从典型相关分析得知，初始因子与效应因子间的相关关系主要是由于x1、x2与x4、x6间的密切联系所造成，这不仅与简单相关分析结果相吻合，也与元雪浈等[10]研究结果一致。这一方面支持了现行APS生物活性检测方法的基本可行性，另一方面也揭示出现行方法中仅规定以试验组和对照组脾指数的差作为判断标准而忽视试验动物性别因素影响的缺陷。
本研究建立回归方程时充分考虑了性别因素，试验组和对照组的回归方程R2均大于0.99，拟合效果很好；
所建立的回归方程比元雪浈等[9]建立的检测模型在自变量筛选方面更精准可靠，使用效果会更好。此回归方程可用于APS生物活性检测时指标的估算和验证，也可作为试验结果判定时的参考。建议有关部门在今后修订APS生物活性检测方法时把小鼠性别作为控制因素做出相应规定。
APS生物活性检测中，试验组与对照组间脾脏重（x4）差异显著（雌性，P＜0.05）或极显著（雄性，P＜0.01），脾指数（x7）差异极显著（雌性和雄性，P＜0.01）；
3个初始因子间简单相关系数均不显著（P＞0.05），5个效应因子间有3个相关系数达到极显著水平（P＜0.01），初始因子与效应因子间的相关系数有4个达到极显著水平（P＜0.01），有1个达到显著水平（P＜0.05）；
初始因子与效应因子间的典型相关系数为0.913 9（P＜0.01）、0.810 2（P＜0.01），两类因子间的相关性主要由x1、x2与x4、x6间的相关关系所造成；
试验组回归方程为x7=6.176-0.068 x2+0.037 x4-0.230 x6（R2为0.992 6），对照组回归方程为x7=3.902-0.052 x2+0.034 x4-0.134 x6（R2为0.992 1）。说明现行的APS生物活性检测方法基本可行，试验时应把试验动物的性别作为控制因素纳入试验设计中，并运用统计学方法判断试验组与对照组的差异，以提高试验的准确性和可靠性。
