贾艳会 华春珍,* 周明明 俞惠 付盼 王传清 许红梅 景春梅 邓继岿 陈运生 张婷 张泓 林爱伟 王世富 曹清 周云芳 邓慧玲 曹三成 赫建华 高巍
(1 浙江大学医学院儿童医院，国家儿童健康临床研究中心，杭州 310003；
2 复旦大学儿童医院，上海 201102；
3 重庆医科大学儿童医院，重庆 400014；
4 深圳市儿童医院，深圳 518026；
5 上海交通大学儿童医院，上海 200040；
6 山东大学齐鲁儿童医院，济南 250022；
7 上海儿童医学中心，上海 200127；
8 西安市儿童医院，西安 710002；
9 开封市儿童医院，开封 475099)
流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，Hi)是一种革兰阴性小球杆菌，主要分为有荚膜和无荚膜菌株两类。大部分的流感嗜血杆菌为机会性致病菌，也是临床中儿童最常分离到的条件致病菌之一[1-2]，该菌主要引起儿童呼吸道疾病，如社区获得性肺炎[2-4]、急性中耳炎、鼻窦炎[2,5]等。该菌在青春前期女童细菌性阴道炎中也是主要的致病菌之 一[6]。严重感染可侵入血流引起脓毒血症、脑膜炎等侵袭性感染[2,4,7]。多年来，治疗Hi感染的首选药物是氨苄西林，但是不同国家和地区，Hi对氨苄西林的耐药率差别较大[8-9]，且耐药率逐年上升趋势明显[8-10]。2016年以来，我国儿科细菌感染性疾病监测协作组(Infectious Disease Surveillance of Pediatrics，ISPED)对不同地域9家儿童医院的Hi进行耐药性监测[11-12]，发现Hi菌株对氨苄西林的耐药率从2016年的58.1%升至2019年的72.1%%，对氨苄西林舒巴坦的耐药率也从17.6%上升至43.0%，临床Hi疾病的治疗面临挑战。新冠疫情之后，在严格的防控策略下，儿童各种感染性疾病的发生率有明显下降，疫情后ISPED关于儿童来源的Hi尚未报道，现将2020年我国9家儿童医院的Hi耐药模式进行分析。
1.1 菌株来源和鉴定
我国不同地域的9家儿童医院组成ISPED协作组，成员单位包括浙江大学医学院附属儿童医院、重庆医科大学附属儿童医院、复旦大学附属儿科医院、上海交通大学医学院附属儿童医院、上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心、深圳儿童医院、西安儿童医院、山东大学齐鲁儿童医院、河南省开封市儿童医院。Hi临床株为2020年1月至12月鉴定者，且在嗜血杆菌选择性培养基上经分区划种半定量达“++”以上。细菌培养和鉴定方法按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)当年指南执行。
1.2 β-内酰胺酶检测和药敏试验
按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2020版指南，采用头孢硝噻酚纸片(BioMériex,France)法检测β-内酰胺酶，采用MIC法(重庆儿童医院和复旦大学儿科医院)或Kirby-Bauer法(其他家儿童医院)进行药敏试验。MIC法使用奈瑟菌/嗜血杆菌检测试剂盒(重庆圣和源科技有限公司)；
Kirby-Bauer法检测的抗生素包括氨苄西林(10 μg)、氨苄西林/舒巴坦(10 μg/10 μg)、头孢呋辛(30 μg)、头孢噻肟(30 μg)、美罗培南(10 μg)、氯霉素(30 μg)、复方磺胺甲恶唑(1.25/23.75 μg)、左氧氟沙星(5 μg)和阿奇霉素(15 μg)，均购自英国Oxoid公司。流感嗜血杆菌 ATCC49247为质控菌株贯穿始终，结果完全合格。
1.3 统计学方法
计数资料用n(%)表示，组间耐药率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 标本来源及分布
共分离到Hi 2244株，其中来自呼吸道标本2104株(93.4%)，非呼吸道标本140株(6.23%)。1312株(58.5%)来自男性，患儿的年龄范围为10 d～16岁，中位数年龄0.92岁。菌株季节性分布显示1～6月份共1146株，占51%，其中以1月份构成比最高，共791株，占35.2%。具体标本分布见表1。
表1 标本类型菌株分布及构成比[n(%)]Tab.1 Specimen type distribution and composition ratio[n(%)]
2.2 β-内酰胺酶检测和药敏试验结果
2020年9 家医院2244株Hi对9种抗生素的耐药情况见表2。β-内酰胺酶阳性株和阴性株对9种抗生素的耐药率比较见表3。呼吸道来源Hi菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦钠、头孢呋辛、复方磺胺甲恶唑和阿奇霉素的耐药率高于非呼吸道来源菌株(P＜0.01)，见表4。2244株Hi中，β-内酰胺酶阳性1451例，占64.6%。β-内酰胺酶阳性且氨苄西林舒巴坦耐药536株，占23.9%。其中175株(7.7%)为β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药Hi(β-lactamase negative and ampicillin-resistant，BLNAR)，BLNAR菌株和β-内酰胺酶阳性株对9种抗生素的耐药率比较见表5。
表2 2020年9家儿童医院分离的2244株流感嗜血杆菌对9种抗生素耐药情况Tab.2 Resistance of antibiotics against 2244 strains of H.influenzaeisolated from patients in 9 children"s hospitals in 2020
表3 β-内酰胺酶阳性株和阴性株对9种抗生素的耐药率比较Tab.3 Comparison of resistance rate of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae between β-lactamase positive isolates and negative isolates
表4 呼吸道来源与非呼吸道来源的Hi菌株对9种抗生素耐药率比较Tab.4 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non-respiratory specimens
表5 BLNAR菌株和β-内酰胺酶阳性株对9种抗生素的耐药率比较Tab.5 Comparison of resistance rates of 9 antibiotics against Haemophilus influenzae isolated between BLNAR and β-lactamase positive isolates
2.3 多重耐药情况
所有菌株中耐3种及3种以上不同种类抗生素的多重耐药菌株1293株，占57.6%。其中β-内酰胺酶阳性株和阴性株的多重耐药率比较，差异有统计学意义(P＜0.001)，见表6。呼吸道来源和非呼吸道来源的Hi株多重耐药率比较，差异有统计学意义(P＜0.001)，见表7。最常见的耐药模式为耐氨苄西林、复方磺胺甲恶唑和阿奇霉素，共735株(56.8%)。同时耐氨苄西林、氯霉素、复方磺胺甲恶唑和阿奇霉素共11株，占多重耐药株0.9%(11/1293)，同时耐氨苄西林、复方磺胺甲恶唑、阿奇霉素和左氧氟沙星共1株，占0.07%。
表6 β-内酰胺酶阳性株和阴性株的多重耐药率比较Tab.6 Comparison of multidrug resistance rates between β-lactamase positive isolates and negative isolates
表7 呼吸道来源和非呼吸道来源的Hi株多重耐药率比较Tab.7 Comparison of multidrug resistance rates against Haemophilus influenzae isolated from respiratory specimens and from non- respiratory specimens
本组Hi的主要标本来源为下呼吸道感染患儿的痰液标本，与该菌是儿童社区获得性肺炎最常见的细菌学病原吻合[3]。此外，3.47%的菌株来自有症状的阴道炎患儿的阴道拭子，提示该菌亦应是青春前期女童外阴阴道感染的常见病原菌[6]，与Wang等[11]2016年的研究数据一致。本组侵袭性菌株少见，仅血流来源12株和脑脊液来源6株，提示该菌引起化脓性脑膜炎侵袭性感染的少见[5,13]，可能与Hi临床株以无荚膜型为主，菌株侵袭力相对较弱有关。儿童Hi感染往往有明显的季节性，不同地区或同一地区的不同年份，因气候条件存在差异，该菌感染的高峰季节可能存在一定变迁，本组分离到Hi以1～6月份最多，与既往我国该菌的季节分布基本一致[11-12]。
10年前，日本和韩国的Hi对氨苄西林的耐药程度远较中国严重，但之后他们的菌株对氨苄西林的耐药率上升幅度并不大，多在70%以内[9-10,14-15]，而本组耐药性分析显示，2020年的Hi菌株对氨苄西林的耐药率已达72.1%，较2016年报道的58.1%有较大幅度上升[11]，值得高度关注，至于是否与耐药克隆在地区克隆播散密切有关，有待对菌株进行遗传背景研究再明确。Hi对氨苄西林耐药的机制有2种，分别是产生β-内酰胺酶破坏抗生素和青霉素结合蛋白3(PBP3)突变导致与氨苄西林等β-内酰胺类抗生素亲和力下降(即BLNAR机制)，其中产生β-内酰胺酶是我国Hi耐氨苄西林的主要机制[6,11-12]，而在本次研究中，β-内酰胺酶阴性耐氨苄西林的菌株占7.7%，较吕志勇等[16]在2015—2019年对Hi耐药性分析中β-内酰胺酶阴性耐氨苄西林的菌株3%有大幅提升，提示BLNAR耐药机制已不容忽视。此外，本研究发现β-内酰胺酶阳性菌株对其他抗菌药物的耐药率、多重耐药率也显著高于β-内酰胺酶阴性菌株，其原因可能与流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶的主要机制和对复方磺胺甲恶唑、氯霉素耐药的机制均由质粒介导，这些耐药基因可整合在同一质粒接合子上,从而导致联合耐药[17-18]。BLNAR因PBP突变，菌株对氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸耐药。但本组中β-内酰胺酶阳性的菌株中也有23.9%的对含酶抑制剂的复合制剂不敏感，这些产酶菌株耐氨苄西林/舒巴坦的机制，是否同时存在fts基因突变导致其编码的PBP3的氨基酸序列改变所致，值得进一步研究。
本研究Hi菌株对氨苄西林的耐药率较国内外以往研究结果均明显升高，氨苄西林不再适用于首选临床经验治疗用药，但本研究Hi对氨苄西林/舒巴坦敏感率为65%，较氨苄西林、头孢呋辛、复方磺胺甲恶唑、阿奇霉素敏感率高，且β-内酰胺酶阳性且氨苄西林舒巴坦耐药占23.9%，氨苄西林舒巴坦仍是可以选择的药物之一。Hi对第三代头孢菌素头孢噻肟和头孢曲松敏感率高，对美罗培南的耐药率仅为0.6%，与我国新型冠状病毒肺炎流行前的研究数据大致一致[6,11-12]，提示对于儿童Hi感染，头孢噻肟或头孢曲松可作为首选用药。而对于严重感染或者威胁生命的侵袭性Hi感染，可考虑使用美罗培南等碳氢霉烯类抗生素[19]。
Hi也可引起泌尿、生殖道感染，同一地区的同一人群中，Hi耐药模式可因感染部位不同而存在较大差异。日本Deguchi等[20]比较呼吸道来源和泌尿道来源的Hi发现，呼吸道来源的Hi中BLNAR株构成比明显高于泌尿道菌株，而BLNAR正是日本Hi耐氨苄西林的主要机制。本研究组既往也曾对儿童呼吸道来源和阴道来源的Hi作过耐药性比较，发现呼吸道菌株对氨苄西林、头孢呋辛、克拉霉素、甲氧苄啶-磺胺甲基恶唑的耐药率显著高于阴道菌株[6]，与本多中心研究结果高度一致，提示对于Hi的抗感染治疗，抗生素的选择因感染部位不同而异。
Hi是一种条件致病菌，常寄居于人的上呼吸道，当前社区及医院对于儿童呼吸道感染在无细菌培养、无药敏指导下抗生素应用普遍广泛，可能导致高度耐药的定植Hi，本研究大多数菌株非无菌标本，所以不能排除定植菌来源，且本次研究侵袭性菌株少见，仅18株，其中氨苄西林耐药率为55%(10/18)，王高良等[21]研究儿童侵袭性Hi感染提示其氨苄西林耐药率为48%，可见侵袭株耐药率反而低。
本研究的局限是，大多数菌株为非无菌标本来源，不能排除定植菌来源，Hi是否为引起患儿感染的病原需结合临床分析；
另外未能对分离到的Hi菌株进行血清分型。随着Hib疫苗的广泛接种，nontypableHaemophilus influenzae(NTHi)成为全球Hi疾病常见的菌型[22]。NTHi产生β-内酰酶的几率高于有荚膜的菌型，同时开展耐药性监测、耐药机制和血清分型研究是研究者今后努力的方向。
