安玉红，关天琪，郭艳红，李 慧,梁世康，黄 涛
(1.贵州食品工程职业学院 食品工程系，贵阳 551499；
2.贵州玄德生物科技股份有限公司，贵阳 550016)
元宝枫(Acertruncatum)属槭树科(Aceraceae)槭属落叶乔木，为我国特有的木本油料作物，广泛分布于辽宁、内蒙古、陕西、贵州等地，是集食用油、观赏、木材于一体的具有较高经济价值的树种[1]。魏伊楚等[2]对内蒙古、辽宁、山东、陕西等9个产地的元宝枫籽油进行检测发现，元宝枫籽的平均含油率为43.30%，元宝枫籽油不饱和脂肪酸含量为87.05%～90.16%，其中亚油酸含量为32.28%，油酸含量为25.36%，神经酸含量为5.25%。2011年我国批准元宝枫籽油为新资源食品[3]，使元宝枫籽油正式进入人们的日常生活。
随着人们生活水平的不断提高，功能性油脂具有的保健和药用功能越来越被认可，功能性油脂的需求量持续增长。元宝枫籽油是目前陆地上已知的食用油脂中神经酸含量较高的功能性油脂，神经酸具有保护和修复脑神经损伤、改善老年痴呆、促进大脑发育等功效[4-5]。但在如今普遍处于高脂、高蛋白膳食的情况下，若将元宝枫籽油作为功能性油脂直接饮用或食用，是否会进一步促进肥胖的加剧，还未见报道。研究表明，摄入大量油脂会影响机体的脂代谢、肠道微生物菌群及肠道微环境[6-8]。目前关于元宝枫籽油作为功能性油脂在改善正常机体肠道菌群，调节肠道菌群的动态平衡方面有一些研究，如：孙朋浩等[9]研究表明，在正常小鼠饲料中添加元宝枫籽可降低小鼠肠道中葡萄球菌属(Staphylococcus)和放线杆菌门(Acinetobacter)的丰度，说明元宝枫籽有抑制肠道有害菌的作用；
梁婵华等[10]研究表明，元宝枫籽油能改善脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的肠道损伤小鼠结肠组织上皮细胞凋亡和黏膜损伤，其机制与下调 Nod样受体蛋白3〔NLRP3 炎性小体相关分子NLR家族Pyrin域蛋白3(pyrin domain contain-ning 3, Nlrp3)〕、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteine-aspartic proteases-1, Caspase1)和凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)等的mRNA表达有关；
陈显扬等[11]研究表明，元宝枫籽油可显著降低正常大鼠肠道厚壁菌门、疣微菌门、放线菌门、艾克曼菌和Paramuribaculum等的丰度，显著增加拟杆菌门和普雷沃氏菌属 NK3B31等的丰度，另外，对连续7 d 服用元宝枫籽油的10名健康志愿者服用前后的粪便进行16S rDNA测序，结果表明，元宝枫籽油可显著降低健康志愿者粪便厚壁菌门、放线菌门、变形菌门等的丰度，显著升高拟杆菌门、乳酸菌的丰度。但元宝枫籽油对高脂膳食机体脂代谢和肠道健康的影响还未见报道。
因此，本文采用高脂膳食诱导小鼠模拟营养过剩诱发的机体肥胖，从小鼠生长状况、生理生化、盲肠微环境和微生物群等指标研究元宝枫籽油对高脂膳食机体脂代谢和肠道健康的影响，以期为消费者食用元宝枫籽油及元宝枫籽油的开发与应用提供一定的理论依据。
1.1 实验材料
元宝枫籽油(油酸含量为24.2%，亚油酸含量为31.7%，神经酸含量为4.38%)，贵州玄德生物科技股份有限公司；
60只SPF级昆明种雄性小鼠〔生产许可证号SCXK(辽)2015-0001〕，体质量18～20 g，辽宁长生生物技术股份有限公司；
基础饲料，重庆腾鑫生物技术有限公司；
DNA凝胶回收试剂盒，德国 Qiagen 公司；
粪便DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；
荧光定量试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司；
总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒，南京建成生物工程研究所；
丙酸(纯度>99.0%)、丁酸(纯度>99.0%)、异丁酸(纯度>99.0%)、戊酸(纯度>98.0%)、巴豆酸(纯度>98%)、丙氨酸(纯度>98%)标准品，Sigma公司；
己酸标准品(纯度≥99.5%)，阿拉丁试剂公司；
其他试剂均为分析纯。
Thermo TRACE 1310-ISQ LT气相色谱-质谱联用仪、Nano Drop 1000微量紫外分光光度计，美国Thermo公司；
SG8200HPT超声波清洗仪；
H1-16KR高速冷冻离心机；
Light Cycler Nano 荧光定量 PCR仪，美国罗氏公司；
SpectraMax190连续波长多功能酶标仪，美国 Molecular Devices公司；
L5S紫外-可见分光光度计；
CTFD-12S真空冷冻干燥机。
1.2 实验方法
1.2.1 动物饲养与样品采集
将60只昆明种雄性小鼠适应性喂养1周后，按体质量随机分为空白组、模型组、元宝枫籽油低剂量组和元宝枫籽油高剂量组，每组15只，每5只1笼。其中元宝枫籽油高剂量组灌胃剂量为1 200 mg/(kg·d)，元宝枫籽油低剂量组灌胃剂量为600 mg/(kg·d)元宝枫籽油和600 mg/(kg·d)大豆油(灌胃剂量参考余德林等[12]的方法改进)，而空白组和模型组灌胃1 200 mg/(kg·d)大豆油。模型组和元宝枫籽油组小鼠在实验期间一直给予高脂饲料饲养，而空白组小鼠给予基础饲料饲养，每天早上8:30—9:00进行灌胃，实验期间自由饮水，每3 d称1次体质量，并调整灌胃量，实验时间60 d。实验最后1 d禁食不禁水12 h，乙醚麻醉后，采用钢尺和软尺分别测定体长和腰围；
然后眼眶取血，于4℃、4 000 r/min离心15 min，-80℃保存，备用；
快速解剖出肝脏、脂肪、盲肠等，称量质量、分装，-80℃保存，备用。高脂饲料配方参照美国营养学会AIN-93G标准[13]配制，配方为：基础饲料78.8%，蛋黄粉10%，猪油10%，胆固醇1%，胆酸盐0.2%。
1.2.2 Lee′s指数的计算
Lee′s指数(x1)按式(1)计算。
(1)
式中：m为体质量，g；
l为体长，cm。
1.2.3 生理生化指标的测定
参考试剂盒说明书，分别测定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。
1.2.4 肠道指标的测定
1.2.4.1 盲肠及其微环境指标测定
盲肠内容物pH和水分的测定参考夏雪娟[14]的方法进行；
盲肠内容物硫化氢(H2S)的测定参照郑扬等[15]的方法进行；
盲肠内容物氨态氮(NH3-N)的测定参照蒲万霞等[16]的方法进行；
盲肠壁表面积和游离氨含量的测定参照游玉民等[17]的方法进行。
1.2.4.2 盲肠内容物短链脂肪酸(SCFA)的测定
参照李明泽等[18]的方法测定盲肠内容物的SCFA。
GC条件：Agilent HP-INNOWAX 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；
进样量 1 μL，分流比 10∶1；
进样口温度 250℃；
升温程序为起始温度 90℃，然后以10℃/min 升温至 120℃，再以5℃/min 升温至 150℃，最后以 25℃/min 升温至 250℃，保持 2 min；
载气(氦气)流速 1.0 mL/min。
MS条件：电子轰击电离(EI)源，SIM 扫描方式，电子能量 70 eV，离子源温度 230℃，传输线温度 250℃，四极杆温度 150℃。
1.2.4.3 盲肠内容物微生物测定
按照粪便DNA提取试剂盒提取DNA后，进行纯度检测。各肠道菌群特异性PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。采用实时荧光定量聚合酶链反应测定各肠道菌群表达量，以各肠道菌群标准为内参计算其表达量[19-20]。
表1 各细菌引物序列及产物大小
1.2.5 数据处理
实验数据以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 21.0及Origin 8.1进行数据统计处理，两组间比较采用Student′st检验，多组间比较采用One-Way ANOVA 进行Duncan分析，以p< 0.05为存在统计学差异。
2.1 元宝枫籽油对小鼠生长状况的影响
元宝枫籽油对小鼠生长状况的影响如表2所示。
表2 元宝枫籽油对小鼠生长状况的影响(n=15)
由表2可知：与空白组相比，在初体质量差异不显著的情况下，经过60 d高脂饲养，模型组小鼠终体质量、腰围、Lee′s指数和腹腔脂肪质量均显著增加(p<0.05)，分别增加了31.23%、28.29%、28.23%和71.77%；
与空白组相比，模型组摄食量显著降低(p<0.05)，降低了19.36%；
与模型组相比，元宝枫籽油高、低剂量组小鼠摄食量减少，但不显著(p>0.05),小鼠体质量、腰围、Lee′s指数和腹腔脂肪质量降低，其中高剂量组作用显著(p<0.05)。以上结果说明元宝枫籽油具有一定的减肥作用，但其作用效果有一定的量效关系。
2.2 元宝枫籽油对小鼠血清脂质水平的影响
元宝枫籽油对小鼠血清脂质水平的影响如表3所示。
表3 元宝枫籽油对小鼠血清脂质水平的影响(n=15) mmol/L
由表3可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平显著升高(p<0.05)，分别升了73.68%、62.64%和188.52%，而HDL-C水平显著降低(p<0.05),下降了49.06%。与模型组相比，元宝枫籽油高、低剂量组小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均显著降低(p<0.05)，HDL-C水平显著升高(p<0.05)，其中，高剂量组小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平降幅分别为21.65%、18.55%和38.07%，而低剂量组小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平降幅分别为9.96%、9.72%和18.75%，高、低剂量组HDL-C水平增幅分别为51.85%和22.22%。以上结果表明，元宝枫籽油具有改善因高脂膳食诱导的小鼠血清脂代谢紊乱的作用，但不能将高脂膳食小鼠恢复到正常水平，具体作用机制还有待进一步研究。
2.3 元宝枫籽油对小鼠盲肠及其微环境的影响
肠道是机体主要的消化吸收场所，盲肠和结肠是肠道微生物最密集和多样的区域。盲肠作为小肠的末端，连接着大肠，此区域是最早接触到大肠方向来源的微生物群落，因而国内外以盲肠研究肠道健康的报道[17,21-24]较多。元宝枫籽油对小鼠盲肠及其微环境的影响分别如表4和表5所示。
表4 元宝枫籽油对小鼠盲肠的影响(n=15)
表5 元宝枫籽油对小鼠盲肠微环境的影响 (n=15)
由表4可知，与空白组相比，模型组小鼠盲肠总质量和盲肠内容物质量显著增加(p<0.05)，分别增加了89.47%和114.81%。与模型组相比，元宝枫籽油低、高剂量组小鼠盲肠总质量和盲肠内容物质量增加，且高剂量组增加显著(p<0.05)。可能是元宝枫籽油中活性物质对小鼠肠道产生了刺激作用，增大了盲肠表面积，加强了小鼠盲肠对营养物质的吸收所致[25]。肠道pH的降低能降低肠癌等肠道类疾病发生的概率[26]，游离氨、硫化氢(H2S)、氨态氮(NH3-N)是肠道健康的重要生物标志物。由表5可知，与空白组相比，模型组小鼠盲肠内容物游离氨、氨态氮、硫化氢和pH显著增加(p<0.05)，分别增加了173.91%、109.52%、18.46%、12.05%，而盲肠内容物水分显著降低(p<0.05)，降低了 14.06%。与模型组相比，元宝枫籽油高、低剂量组小鼠游离氨和氨态氮含量显著降低(p<0.05)，高剂量组硫化氢含量和pH显著降低(p<0.05)。以上结果说明，高脂膳食会影响小鼠盲肠及其微环境，而元宝枫籽油可降低因高脂膳食造成的小鼠盲肠代谢产物的毒害损伤。
2.4 元宝枫籽油对小鼠盲肠内容物SCFA的影响
肠道SCFA可以反映机体肠道内厌氧菌的数量和代谢情况，其组成和含量与肠道微生物菌群存在一定的相关性，如乙酸、丁酸和丙酸与瘤胃球菌属(Ruminococcus)和乳酸菌(Lactobacillus)呈正相关，而丁酸与双歧杆菌(Bifidobacterium)和阿克曼氏菌(Akkermansia)呈正相关[27]。元宝枫籽油对小鼠盲肠内容物SCFA的影响如表6所示。
表6 元宝枫籽油对小鼠盲肠内容物SCFA的影响(n=15) μmol/g
由表6可知，与空白组相比，模型组小鼠盲肠内容物中SCFA总量、丁酸、异丁酸、戊酸和丙酸含量显著降低(p<0.05)，分别降低了28.09%、32.74%、11.22%、18.67%和25.65%。与模型组相比，元宝枫籽油可增加小鼠盲肠内容物中SCFA总量、丁酸、戊酸、丙酸和异丁酸含量，其中：元宝枫籽油高剂量组小鼠盲肠内容物中SCFA总量、丁酸、戊酸和丙酸的含量显著增加(p<0.05)，分别增加了19.93%、25.54%、9.94%和18.31%；
而低剂量组小鼠盲肠内容物中丙酸含量显著增加(p<0.05)，增加了23.94%。以上结果表明，元宝枫籽油具有促进高脂膳食机体肠道内的发酵反应，改善肠道菌群稳态失调的作用。
2.5 元宝枫籽油对小鼠盲肠内容物中微生物的影响
元宝枫籽油对小鼠盲肠内容物中微生物的影响如表7所示。
表7 元宝枫籽油对小鼠盲肠内容物中微生物的影响(n=15) lg(copies)/g
由表7可知，与空白组相比，模型组小鼠盲肠内容物中乳酸杆菌、双歧杆菌和梭菌的量显著降低(p<0.05)，分别下降了28.88%、18.41%和29.76%，而肠杆菌、肠球菌和拟杆菌的量显著升高(p<0.05)，分别上升了24.09%、28.79%和15.73%。与模型组相比，元宝枫籽油高、低剂量组小鼠盲肠内容物中乳酸杆菌、双歧杆菌和梭菌的量均显著增加(p<0.05)，而肠杆菌、肠球菌和拟杆菌的量显著减少(p<0.05)。以上结果表明，元宝枫籽油可改善因高脂膳食造成的小鼠盲肠代谢产物的毒害损伤，增加有益微生物，促进肠道健康。
以高脂膳食小鼠模拟机体营养过剩，从生长状况、血脂、肠道微环境3个方面研究元宝枫籽油对高脂膳食小鼠脂代谢和肠道健康的影响。结果表明：元宝枫籽油直接饮用或食用，并未加重高脂膳食小鼠脂代谢紊乱，以及促进肥胖的发生；
但元宝枫籽油并不能将高脂膳食小鼠恢复到正常水平。此外，元宝枫籽油可改善因高脂膳食造成的小鼠盲肠代谢产物的毒害损伤，增加有益微生物量，具有一定的维持肠道健康的作用。后续将采用16S rDNA测序、代谢组学、转录组学及网络药理等进一步探明元宝枫籽油对高脂膳食机体脂代谢和肠道健康的影响机制。
