口蹄疫液相阻断ELISA试验方法应用

时间:2023-06-14 18:00:07 公文范文 来源:网友投稿

文│刘占艳(山东省无棣县畜牧兽医管理服务中心)

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的,主要引起偶蹄动物的一种急性、烈性、危害性大的传染病,以O型和A型血清型多发。该病发病速度快,传播范围广,对畜产品质量安全和进出口贸易造成重大危害,不利于畜牧业的绿色健康发展。

1.临床诊断。口蹄疫是RNA病毒,为二十面体的球形结构,主要感染牛、羊、猪等偶蹄兽,发病速度快,传染性强,病程3~10天,发病率100%,感染动物出现发热、精神萎靡、食欲减退,主要特征是口、蹄、鼻等部位出现水泡,破损后留有结痂。幼龄动物感染后,如果护理不到位,死亡率100%,成年动物感染后,消瘦、生产能力下降,部分动物自愈后,无明显症状,会长期带毒,成为隐性感染,给畜产品交易和食品安全带来重大隐患。

2.实验室诊断。在基层兽医实验室,主要应用液相阻断ELISA实验方法检测偶蹄动物的血清,不足之处是耗时费力,检测通量低。笔者在多年动物疫病实验研究基础上优化了检测方法,提出高通量液相阻断ELISA口蹄疫病毒检测法,检测的准确性提高2~3倍,节约了时间,节省了移液枪头等实验耗材,降低了检测成本。做好高通量液相阻断ELISA实验方法的关键因素是确定合适的血清稀释倍数,考虑不同稀释倍数有不同的检测范围,试验中把羊血清直接配比稀释成1∶8,可以保证检测数据的准确性和真实性,更好地为养殖户提供批量检测。

该方法的原理是在液相条件下将待检血清与病毒反应,病毒与特异性抗体充分结合,推断出待检血清中特异性抗体的数量。笔者从事兽医实验室抗体监测工作十余年,现以检测20份羊血清的O型口蹄疫病毒为例,将高通量液相阻断ELISA试验方法的工作经验总结如下。

1.检测样品。采集20份羊全血样品后应尽快分离出血清(样品不能有溶血状态、受污染、破损、变质),编号为S1~S20。

2.试验器材。酶标仪;
37℃恒温箱;
超纯水仪;
单道和多道移液器;
配套移液枪头;
96孔U型血清稀释板;
移液槽;
吸水纸;
检测试剂盒是兰州兽研生物科技有限公司生产的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(改进型)。

3.实验操作步骤。稀释20份羊血清需要1块96孔U型微量稀释板,在血凝板边缘标记数字(横向标记为1~12,纵向标记为A~H)。先在稀释板的A1~A10、B1~B10孔中加入PBST稀释液140微升/孔,然后在以上20孔加入待检血清样品20微升/孔,混匀后把血清混合液取出100微升移到抗原包被板的A1~A10、B1~B10孔中,并做好标记。

包被板C、D、E、F、G、H列的1~10孔分别加入PBST稀释液50微升/孔。再用10~300微升8道或12道移液器以50微升/孔的量稀释从第A~D列S1~S10血清混合液,DS1~DS10混合液吸出50微升弃掉。第E~H列S11~S20样品同上依次稀释,HS11~HS20混合液吸出50微升弃掉。

阳性对照稀释:在抗原包被板A11~H11孔先加入PBST稀释液50微升/孔,然后在A11孔中加入阳性对照血清(已稀释浓度为1∶8)50微升,混匀后以50微升/孔的量依次稀释到H11孔,从H11孔中吸出50微升弃掉。阴性对照稀释:在抗原包被板A12~B12孔先加入PBST稀释液50微升/孔,然后在A12孔中加入阴性对照血清50微升,混匀后吸出50微升移到B12孔,从B12孔中吸出50微升弃掉。

由表3可知,抗体效价大于或等于1∶128时判定为口蹄疫O型抗体阳性,抗体效价1∶64~1∶128判为可疑,小于1∶64判为阴性。读数结果:本次试验ELISA包被板试验结果有效,计算出OD值=0.87,抗体阳性孔数20个,抗体阳性合格率100%。

表3 20份羊血清O型口蹄疫检测结果

4.分析与总结。在液相阻断ELISA抗体检测试剂盒说明书的基础上,结合工作实际经验,待检血清提前进行倍比稀释,倍比稀释后再把血清稀释液从稀释板转移到包被板上。本次试验中把羊血清直接配比成1∶8,将混合均匀的血清稀释液按100微升/孔的量,从稀释板直接移到包被板A1~A10孔中,然后取50微升/孔,用多头移液枪在包被板上直接稀释成所需比例。

高通量液相阻断ELISA试验方法的好处:保证血清稀释液移板时是足量的,节省了稀释后移板的一部分时间,按转移1个血清样品用时5秒计算,20个样品可节时1.5分钟,提高了工作效率;
节省大量的移液枪头,节省了试验耗材,可用于大批量的口蹄疫免疫效果检测;
用PBST稀释液洗板时,若洗涤液少了洗板不均匀达不到洗板效果,若洗涤液多了在操作过程中容易溢出造成混孔混样,笔者根据多次试验经验认为用量260~280微升/孔较好。

1.促进畜牧业绿色发展。现如今,人类新发疾病绝大多数来源于动物和动物源性食品,通过免疫无疫区高标准的建设,有效控制和扑灭了重大动物疫病,有效保护了人类生命安全和维护公共卫生健康。建立健全生物安全工作环境,最大限度地减少动物疫病流行造成的社会和经济损失,减少了人畜共患病和动物性食品残留对人体的危害,降低动物疫病带来的食品安全风险给社会提供安全放心的食品。

2.提升畜产品质量安全。通过对动物疫病免疫效果的检测可以推动免疫无疫区的建设,进一步推进无疫区绿色、安全、放心畜产品品牌的影响力,全方位提高畜产品市场占有率,培育优质畜产品新品牌,提升新品牌建设和畜产品质量品质,提高畜产品出口贸易,吸纳国内外饲料、兽药和科研机构等来无疫区投资生产。

3.助力“无疫区的建设”。山东省在全国率先推行强制免疫“先打后补”,又于2022年7月初通过了全国动物卫生风险评估专家委员会的审议,成为首个全省域通过口蹄疫、高致病性禽流感“双病”无疫区的省份。无棣县地处山东省的北大门,将切实筑牢动物疫病防线,擦亮“无疫省”金字招牌,依靠县疫控中心兽医实验室,利用口蹄疫液相阻断ELISA等检测方法可更好地做好口蹄疫、高致病性禽流感的抗体检测工作,提供科学、有力、坚实的数据做支撑,为维护“无疫省”和强制免疫“先打后补”高标准、高水平长效运行,进行保驾护航。

近些年,全球疫情频发,口蹄疫作为重大动物传染病,在我国主要为O型和A型,呈零星散发,给畜牧业发展和畜产品交易带来不利影响。为了减轻动物疫病的发生,我国采取因地制宜、强制免疫和疫病持续监测净化的防控措施。通过液相阻断ELISA等检测方法,降低了成本,提高了检测效率和准确度,及时评价疫苗免疫效果,实现更为经济、高效的检测口蹄疫疫情,助力畜牧业持续绿色健康发展。

表2 96孔包被板加入20份血清布局图

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