陈云娇，屈阳阳，李 杰，贾伟娟，郗珊珊，何云江，孟庆磊，王学理
（1内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽 028042；
2通辽市动物疫病预防控制中心，内蒙古通辽 028001；
3通辽市库伦旗动物疫病预防控制中心，内蒙古通辽 028200）
新城疫(newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，可感染250多种禽类[1-3]。该病通过侵害心血管系统，造成血液循环高度障碍，从而引起全身性炎性出血、水肿。疾病后期，病毒侵入中枢神经系统，引起非化脓性脑炎变化，导致神经症状出现[4-6]。NDV主要感染禽类，人感染的情况十分少见，但感染后可导致结膜炎和流感等症状。该病最早出现在印度尼西亚的爪哇(Java)和英国的新城(Newcastle)，1927年Doyle首次分离出病原，并将该病命名为新城疫[7]。
恶性肿瘤在中国发病率较高，已成为人类死亡的主要原因之一[8]。目前使用的治疗方案并没有很大程度地提高恶性肿瘤患者的生存率，因为它们的治疗效果十分有限[9-11]。自20世纪50年代首次发现NDV能够抑制晚期胃癌细胞转移以来，许多研究已经证实NDV可特异性杀伤肿瘤细胞，同时还能刺激免疫系统以提高机体自身的抗肿瘤能力[12-13]。
NDV属副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属。为单链负股RNA病毒，整个病毒粒子有囊膜，直径大小约100～400 nm，从形态学来看，NDV为一个多形性包膜粒子（如图1）[14-15]。ND是最具有破坏性的家禽传染病之一，该病对商品家禽的生产具有相当大的威胁[16-18]。从1926年英格兰泰恩河畔纽卡斯尔的第一次官方报告至今，许多国家都出现了ND爆发的报告，由于其具有高死亡率、高发病率的特征，在世界各地造成了严重的经济损失[19]。NDV可分为I类和II类，I类包含1个基因型，II类包含21个基因型(I-XXI)，新城疫病毒感染和特异性杀伤恶性肿瘤细胞的能力，取决于病毒的毒株和致病类型[20-23]。尽管新城疫病毒是以禽类为天然宿主的病毒，但其已被多项研究证实是一种安全有效的溶瘤病毒，当前已有多个新城疫毒株用以临床溶瘤研究[24-26]。
图1 新城疫病毒的结构特征
2.1 NDV病毒的溶瘤作用机制
目前，癌症是人类的致命疾病之一，尽管现代治疗方式有所改善，但仍需要新的治疗措施的出现来降低致死率。溶瘤病毒疗法是治疗癌症的很有前景的非传统方式[27]。作为溶瘤病毒之一的新城疫病毒，通过在特定的肿瘤细胞中不断增殖，从而导致该细胞溶解。该病毒不能在人健康细胞中复制，具有较好的安全性（如图2）[28-29]。徐全宇等[30]通过在裸小鼠体内建立人肺腺癌细胞系移植瘤动物模型，设置2个实验组，在其中一组小鼠的移植瘤体内局部注射NDV以及携带HN、F基因的质粒（pSV HN和pSV F）作抗肿瘤研究，并且设置PBS对照组。研究显示，实验组对肿瘤的生长有明显的抑制作用，抑瘤率高达79.40%。WANG等[31]在有前列腺癌细胞源性肿瘤的裸鼠体内注射溶瘤新城疫病毒FMW株，利用模拟处理的肿瘤生长组作对比实验。结果表明，前列腺癌细胞被NDV-FMw感染后肿瘤生长比模拟处理后生长得更小。溶瘤新城疫病毒激活了前列腺癌细胞中肿瘤免疫原性细胞死亡(ICD)标志物的表达，抑制了STAT 3（信号转导和转录激活因子3）和溶瘤NDV的结合，提高了NDV的抗肿瘤效应。郭顺利[32]为了能够提高NDV的溶瘤效果，利用反向遗传技术构建并获取能表达IP10蛋白的重组新城疫病毒(rNDV-IP10)，同时检测了rNDV-IP10杀伤肿瘤细胞的能力。将H22肝癌小鼠模型随机分为3组，分别注射PBS、NDV和rNDV-IP10，观察12天并测量肿瘤体积大小。结果显示，rNDV-IP10组实验鼠与PBS组、NDV组相比肿瘤生长较慢，肿瘤体积小于0.05。结果说明rNDV-IP10在肝癌动物模型中具有更好的抑瘤效果。
图2 NDV溶瘤作用机制
病毒性溶瘤是免疫治疗的重要途径之一，相比传统的化疗或放疗方法，其特异性更高、安全性良好且副作用更小[33]。溶瘤病毒可以通过直接感染、裂解癌细胞、激活免疫系统等途径发挥抑瘤或消除肿瘤的作用。由此可见，NDV可作为一种安全的溶瘤制剂或者肿瘤疫苗载体。
2.2 发挥抑瘤佐剂作用
在新城疫病毒发挥抗恶性肿瘤作用时，病毒中某些基因会在肿瘤细胞内发挥抑制其生长的辅助作用。NI等[34]以编码NDV血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白的质粒刺激荷瘤小鼠来研究先天性抗肿瘤活性的能力，并设立了未编码HN的对照质粒组。结果显示，与不编码HN蛋白的对照质粒相比，接种pHN DNA质粒后，小鼠NK细胞浸润显著增加，降低肿瘤生长，pHN质粒在小鼠耳咽部可以激活肿瘤微环境中的免疫细胞来抑制肿瘤的生长。因此，这表明了HN基因在肿瘤治疗中具有一定的潜在佐剂活性。马洪琴[35]为了研究和分析NDV抗膀胱癌的作用效果，采用小鼠膀胱肿瘤模型(BST739)进行研究，分别将卡介苗(BCG)、丝裂霉素(MMC)以及NDV病毒注入小鼠膀胱肿瘤内及肿瘤对侧，观察肿瘤的生长变化。结果显示，BCG、MMC和NDV对膀胱癌细胞均具有一定的杀伤作用，且NDV试验组的2种注射方式均能够对肿瘤的生长产生抑制作用，且注射至瘤内相比于注射瘤对侧的效果更显著。郭灵华等[36]通过鸡胚增殖新城疫病毒LX/(IL-7)，首先用200 μg/mL丝裂霉素C处理2×107CFU/mL Hepa1-6细胞，再将LX/(IL-7)病毒感染处理过的细胞，制成疫苗，将疫苗注射至小鼠肝癌模型中。对照组小鼠皮下接种1×106个丝裂霉素C处理的Hepa1-6细胞，通过测量肿瘤体积来研究肿瘤疫苗的抗肝癌作用。结果发现，对照组小鼠肿瘤体积是实验组的4倍左右。说明LX/(IL-7)病毒可以高效地感染肝癌细胞并分泌IL-7。经LX/(IL-7)修饰的Hepa1-6瘤苗具有较好的肿瘤免疫治疗效果，携带IL-7的新城疫病毒肿瘤疫苗具有显著抗肝癌作用。
以上研究结果表明，抑瘤佐剂作用在抗肿瘤过程中效果十分显著，可有效的控制恶性肿瘤的生长，减少癌细胞的扩散。探明NDV的抑瘤佐剂机制，为在不远的将来在临床利用新城疫病毒治疗恶性肿瘤提供了很大的可能。
2.3 增强免疫细胞活性
NDV在抗恶性肿瘤的过程中，可以增强参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞的活性，从而强化病毒抗恶性肿瘤的作用[37]。APOSTOLIDIS等[38]鉴定了一些NDV毒株的抗肿瘤特性，筛选出溶瘤株MTH-68/H是最强的α干扰素诱导剂，经紫外线灭活后，它是唯一一株在体外诱导人外周血单个核细胞产生抗肿瘤活性的NDV株。使用局部应用模型来治疗荧光素酶转染的CT26结肠癌细胞的肝转移时，溶瘤株MTH-68/H表现出明显的延缓肿瘤生长，延长生存期，局部区域应用新城疫病毒溶瘤比全身静脉注射更有效。李德山等[39]利用重组新城疫病毒(rNDA)治疗肝癌肺转移鼠，将免疫调节基因白细胞介素2(IL2)插入rNDV基因组，获得病毒株rNDV-IL2。通过MTT法检验rNDV-IL2对肝癌HepG2细胞体外抑制效果。通过小鼠尾静脉注射H22肝癌细胞，构建肝癌细胞肺转移模型，在小鼠腹腔注射rNDV和rNDV-IL2，治疗肝癌肺转移模型小鼠，未治疗组作对照，观察小鼠存活情况。结果表明，对照组和实验组小鼠30天成活率分别为0.50%和77.8%。rNDV-IL2有效感染HepG2细胞，表达外源基因IL2并抑制HepG2细胞增殖。重组新城疫病毒rNDV-IL2治疗试验动物后，体内的IL2基因表达量提高，重组新城疫病毒有效控制转移灶形成，且显著促进了T细胞的增殖，提高了试验动物的存活率。
2.4 诱导肿瘤细胞凋亡
NDV能刺激和增强自然杀伤(NK)细胞对肝癌细胞系的杀伤能力，在肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)的抗肿瘤活性中起重要作用（如图3）[40]。其原理是新城疫病毒能中和IFN-γ抗体，消除NDV对TRAIL表达的抑制，进而增强NK细胞的肿瘤杀伤活性。研究发现，新城疫病毒诱导癌细胞凋亡可能与B淋巴母细胞瘤-2基因(bcl-2)含有相同的结构域有关，而bcl已被证明是诱导癌细胞凋亡的重要基因之一[41]。白海[42]从近50株新城疫毒株中筛选出一株被命名为NDV-FMW的病毒株，通过MTT方法筛选出该病毒株对人肺癌细胞株A549和肝癌细胞株SMMC 7721等肿瘤株都具有较好的抑制作用。结果表明，在24 h时，出现明显的形态学变化，细胞变圆；
48 h时，细胞呈悬浮状态生长，透光性变差；
72 h时，大量细胞死亡。NDV-FMW株的抑制率可达到60%以上，该毒株能够激活细胞凋亡信号通路，使肿瘤细胞死亡抑制肿瘤生长。薛立娟等[43]以PIRESlneo为表达载体构建了NDV HN基因的p IRHN载体疫苗，在体外转染HeLa细胞，检测p IRHN在真核细胞当中的表达状况，同时测定HeLa细胞唾液酸含量的变化。结果显示，p IRHN能够在真核细胞中表达，能够使HeLa细胞唾液酸含量减少，通过诱导细胞凋亡促进肿瘤细胞死亡，表明了其死亡方式主要以诱导细胞凋亡为主，通过其表达产物与肿瘤细胞唾液酸受体的相互作用，发挥其抗肿瘤作用。米志强等[44]以p VAX1为表达载体构建了含NDV HN基因的p VHN载体疫苗进行体内外的抗肿瘤研究。结果显示，含HN的载体疫苗pVHN表达后具有血凝活性并致肿瘤细胞表面唾液酸含量降低(P＜0.05)。pVVP3的转染能导致OS732细胞凋亡，凋亡率可达87%。试验结果表明，pVVP3和pVHN两个载体疫苗体外应用后能诱导肿瘤细胞凋亡并显著降低肿瘤细胞表面唾液酸含量。白杨[45]为了观察NDV对胶质瘤是否有辅助治疗作用，将NDV注射到患有恶性肿瘤的Wister大鼠体内并观察。结果显示，在胶质瘤细胞中，NDV可以通过抑制胶质瘤细胞中活化的内源性蛋白激酶B(Akt)及其下游分子同时激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)起到抑制胶质瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用。以上结果表明，NDV能使恶性肿瘤细胞线粒体膜电位降低，使肿瘤细胞凋亡，有效抑制肿瘤生长。因此，诱导肿瘤细胞凋亡在新城疫病毒抗恶性肿瘤机制中起着重要作用，已成为治疗肿瘤的理想方法。
图3 NDV诱导免疫细胞作用机制
新城疫是具有高度传染性的禽类疾病，给许多国家的家禽养殖业造成了巨大损失，但是NDV在治疗恶性肿瘤方面有着巨大的优势，NDV可以选择性地感染人类肿瘤组织，能在肿瘤细胞质中选择性的复制而不依赖于细胞的增殖，通过直接杀死癌细胞或吸引免疫细胞等方式来清除被感染的肿瘤细胞，属于非致病性的病毒[46-47]。从20世纪60年代至今，研究人员已对73-T、MTH-68、PV701、HUJ和LaSota等NDV减毒株或弱毒株开始了Ⅰ期、Ⅱ期以及Ⅲ期药物的临床试验，观察到大部分病例有较好的疗效，但是许多临床试验中出现NDV外源基因插入位点、NDV注射时间及注射次数控制不好的问题，且临床总体例数较少，未有重复试验，说明现有的NDV弱毒株或减毒株的治疗方法还存在不足，不能广泛使用[48-51]。因此，急需探索出治疗肿瘤时插入NDV的外源基因最佳位点，使外源治疗基因能够达到最高表达水平，且对NDV在肿瘤细胞内的复制影响最小，同时，也要不断探索最佳注射时间和注射次数以优化临床治疗肿瘤的效果，研发出更为高效的重组新城疫疫苗来降低肿瘤的发病率和致死率。
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