李俊儒 杨芳 孙鑫 刘彤 王致远 付夜平
辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847
“肾藏精主骨”理论源于《黄帝内经》，紧密联络了“肾藏精”与“肾主骨”之间的转化关系，归属于中医基础理论的藏象学说，后世在继承和创新中对这一理论进行不断地深入探析。肾主封藏，阐述了肾对骨的结构和功能具有“管理”作用，主要是体现在“骨”的生长、发育以及相关的支配肢体关节功能等方面。骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由于骨代谢平衡受损导致骨量减少，并伴随着脆性骨折的高风险，主要特征是骨形成减少、脂肪细胞聚集在骨髓间室、破骨细胞生成增加、成骨细胞生成减少。表观遗传学描述了基因和环境之间的相互作用，二者共同塑造了生物体的遗传特征[1]，这与中医整体观念中人与环境的统一基本一致。人体与自然环境有着密切的关系，随着自然环境的变化而有着直接或间接的变化，表观遗传学中提出的表型也与这一学术思想相对应。表观遗传机制是细胞命运分化程序的关键调节器，在衰老过程中会发生变化，也可以驱动成骨细胞和破骨细胞的分化以及增强骨细胞的活性。表观遗传学是指在基因序列不发生改变的情况下，在表达过程中发生的可遗传的变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA的调控等。DNA甲基化是对基因的一种类似于“枷锁”或“封印”的可逆反应。研究[2]发现，DNA甲基化修饰对成骨机制的调控作用可能与“肾藏精主骨”有关，补肾中药可以改变甲基化水平。本文基于“肾藏精主骨”理论，通过对甲基化修饰与骨质疏松症的密切关系进行讨论，分析甲基化修饰与肾藏象相关理论的科学内涵。
1.1 “肾藏精主骨”理论
中医学认为，肾主封藏，肾中所藏之精为禀受于父母，为先天之本，是人体生命活动的本源。肾藏精，主生长发育和生殖功能，《素问·上古天真论》[3]说明了“生长壮老取决于肾”这一进程，即生长发育与肾中精气盛衰变化密切相关[4]，“女子七岁，肾气盛……四七，筋骨坚……丈夫八岁，肾气实……四八，筋骨隆盛……八八，天癸竭，精少，肾脏衰。”筋骨的强健和充盛直接体现了肾中所藏之精在人体中的变化，和与年龄相对应的盛衰过程。《灵枢·天年》云：“……九十岁，肾气焦，藏枯，经脉空虚。百岁，五脏皆虚，神气皆去，形骸独居而终矣”，总结了人体中五脏衰老的顺序，肾主封藏，对于先天之本的保持和储备，当肾中封藏之精枯竭，周身经脉空虚，形体衰老，骨质改变，功能活动衰退。肾精亏虚，骨髓失去充养，老年性骨质疏松症的发展日趋加重。《素闻·六节脏象论》中对“肾主骨”理论进行了详细论述 ：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也；
其华在发，其充在骨……”骨骼的运动等生理活动与肾有密切的关系，在中医学理论中主要以“肾主骨”理论作为基石。《素问·灵兰秘典论》中认为“肾者，作强之官，技巧出焉”，肾藏精主骨生髓，骨髓充盛，人体在活动时灵巧敏捷，然肾中精气虚衰，骨髓失充，骨减而肢体无力。由此可见，肾藏精与肾主骨之间的紧密联系，后经历代医家的逐步探讨，最终形成“肾藏精主骨”理论。
1.2 “肾藏精主骨”学说发展
在中医基础理论中，对“肾”的阐述与现代医学不同。中医认为“肾”是一个综合的“系统”，并不仅仅代表解剖上的结构位置。《素问·五运行大论》曰:“北方生寒，寒生水，水生咸，咸生肾，肾生骨髓……在体为骨，在气为坚，在脏为肾。”《医部全录》提到:“肾主冬藏，故为蛰封藏之本。”肾精化生骨髓充养骨骼，肾之精气充沛，则筋骨健壮。肾藏精主骨，储存和控制人体的“精华”，调节生长发育，负责骨骼的生长和修复。《素问·痿论》中提出：“肾主身之骨髓”。肾中所蕴藏之精华，可以转化成骨髓，储存在骨骼腔中，滋养骨骼。若肾气充沛，骨髓有源可生，则骨骼强壮。《素问·逆调论》云：“肾不生则髓不能满”。若肾精不充，骨髓化生无源，骨骼无以滋养，就会导致“骨枯”“骨痿”等疾病。《医法心传》语：
“在骨内髓足则骨强”，若“肾衰”则“形体疲极”；
《医经精义》载：“髓者，肾精所生，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强” 对肾精生髓、精髓互化、髓骨互养作了进一步的论述。从解剖位置的角度来看，肾与骨并不能与中医学所说的“骨”“肾藏”完全对应，但从肾与骨的生理病理关系来看，“肾主骨”与现代医学的肾、骨是相通的。研究表明，骨骼的代谢与肾上腺素、甲状腺素、甲状旁腺素、肾上腺素等激素的共同作用有关，在下丘脑-垂体-靶腺轴的调节下，形成交叉的调控网络。“肾主骨”的病理变化“肾虚骨枯”是由“下丘脑-垂体-肾上腺-骨细胞轴”的作用所致，进而导致了骨骼代谢在分子生物学微生态中的失衡，补肾中药可以调节骨骼代谢轴调控骨组织内的动态平衡[5]。由此可见，肾与骨在现代医学上确实具有相关性，然其中具体机制尚为繁杂。近年研究发现，SOST基因甲基化[6]在骨代谢中调控成骨，组蛋白去甲基化酶JMJD2[7]影响雌激素相关受体的表达，以及鹿茸中药复方可降低骨组织Runx2、Osterix启动子甲基化水平[8]等，均表明骨形成与骨吸收机制的探索正逐步向表观遗传方向聚焦。
DNA甲基化经常被描述为一种“沉默”的表观遗传学标志[9]，与基因沉默、染色质修饰、胚胎发育等有关[10]，是由DNA甲基转移酶(DNA methyl transferases，DNMT)介导，将胞嘧啶核苷酸与S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)作为CpG岛上胞嘧啶残基进行共价结合修饰。DMNT是基因甲基化研究的热点，DNMT3A通过与SAM介导的代谢途径偶联来调节破骨细胞分化[11]，提示与DNA甲基化修饰相关的靶点可以为预防和治疗各种骨骼疾病开辟一条新途径。Li等[12]研究发现，miRNA -149高甲基化状态下会激活SDF -1/CXCR4信号通路以促进间充质干细胞的成骨分化，而DNMT抑制剂5-aza-CdR可以逆转这一作用，促进了miR-149与SDF-1的结合，抑制成骨。
将遗传关联中的发现转化为骨生物学和OP的潜在生物学机制仍然具有挑战性，主要是因为大多数关联来自非编码变异，缺乏骨骼特异性组学资源，并且很难建立变异、基因和性状之间的因果关系。近年来，全基因组关联研究(GWAS)已经确定了500多个与骨密度和骨质疏松症相关的遗传位点。获取人类骨样本存具有在一定难度，因此有一些研究尝试运用外周血中的生物标志物作为评估指标。Ebrahimi等[13]在研究骨骼与血液的在表观基因组上的跨组织关联时，发现总共有28 549个CpG位点在骨骼和血液中发生了类似的甲基化，并且33 %～49 %的位点与GWAS的骨表型相关，丰富了与骨调节相关的主要途径，认为血液可以捕获与骨调节相关的甲基化位点。在今后的DNA甲基化研究中，外周血中相关生物标志物的检测或许可以作为补充或初步判定。
基于“肾藏精主骨”理论，中医药对骨质疏松症的防治研究越来越多，具体的调控机制也在逐渐探索中。补肾中药对骨质疏松症动物模型的研究结果清晰的报道了最新情况，为中医表型与人类基因表型、中医学与表观遗传学的探索奠定了基础。
肾藏精，精生髓，骨髓滋养骨骼、强壮骨骼，促进骨的生长和修复。现代医学也认为，肾虚可能会降低性腺轴调节的雌激素水平引起骨质疏松。补肾中药或复方可以提高雌激素水平，缓解骨质疏松，如补肾阴中药女贞子、墨旱莲、当归、二至丸、六味地黄丸、左归丸[14]等。中药以植物、动物和矿物入药，而甲基化修饰在调控真核生物正常发育起到关键作用，那么中药与甲基化修饰形成相互作用，机制网络交互也不足为奇，二者在分子水平上的交互是必然的，也是今后研究的热点方向。Liu等[15]研究发现六味地黄丸可以下调Wnt/β-catenin途径，并抑制炎症反应和间质转化来减轻糖尿病所致的骨质疏松症，这个过程也阻断了KDM7A，说明中药干预治疗机制与甲基化修饰的调控是有交互的，但具体相关的甲基化调控情况有待进一步探索。Kim等[16]发现牡荆素可以提高Dlx5和RUNX2蛋白水平，促进成骨分化，从而提高成骨细胞的活性。
近年来，中医药和甲基化修饰在疾病机制调控方面的研究日益增多。甲基化修饰在分子水平上调控基因表达，可以结合中医药多组分、多靶点的特点，探索中医药在基因表达平衡中的作用。在病理机制复杂的疾病中，DNA甲基化失衡的常见模式是通过干扰甲基化、去甲基化进行双向调节，包括与组蛋白、miRNA的相互影响，这与中医的防治理念基本一致。经网络药理学分析和体外实验的验证，补肾健脾活血方[17]可以调控去甲基化酶JMJD2B、RUNX2，促进成骨分化。王剑等[18]研究发现中药补肾中药对去卵巢骨质疏松大鼠的Leptin启动子甲基化水平明显低于阳性对照组，认为补肾中药复方可以降低Leptin启动子甲基化水平，有效防治绝经后骨质疏松症。补肾健脾针刺疗法[19]通过降低去卵巢骨质疏松模型大鼠骨组织 Runx2 启动子甲基化水平，上调 Runx2 的表达，进而促进骨形成。杨锋等[20]实验结果显示，左归丸可以降低RUNX2、Osterix、OC、β-catenin基因甲基化率，上调基因表达，通过去甲基化机制促进 BMSCs 向成骨细胞分化。基于“肾藏精主骨”理论，以补肾法作为核心治法，也可能是通过调节甲基化修饰发挥作用，进而有效防治骨质疏松，为临床诊疗提供依据。
DNA甲基化修饰对基因表达的调控，提示人们在表观遗传方向上寻找新的治疗方法。中药对相关转录因子、甲基化酶等蛋白的上调或下调的作用机制尚不明确，相关的信号通路、分子修饰位点、交互作用等值得进一步探索，进行从间接机制到直接机制的层层剖析。祖国医学认为，骨质疏松症的发生发展与肾密切相关，肾主藏精，为先天之本，骨骼的生长发育与肾中精气的充盛密切相关。运用补肾中药治疗骨质疏松症可能是参与了RUNX2、Dlx、Leptin等的启动子甲基化的调控，但具体位点、相关分子交互作用还有待补充研究。目前，中药对DNA甲基化修饰的调控，介导成骨细胞分化或影响破骨细胞形成的具体机制尚不完全明确，多个调节轴的确立还需动物实验和人体组织病理变化的补充验证。随着中医药成分的不断探究，中医药对骨质疏松症的防治会继续在表观遗传等机制上进行探索，补充中医药分子水平的研究，为临床实践提供更多的思路。
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