吴中杰，谢连科，王晶辉，黄仁亮
（1 国网山东省电力公司电力科学研究院，山东 济南 250002；
2 天津大学海洋科学与技术学院，天津 300072）
随着酚类物质在木材防腐、农药、消毒剂等领域的广泛应用，酚类化合物已成为土壤和地下水中常见的有机污染物[1]。因其具有致癌、生殖毒性、神经毒性等特点，严重威胁人类健康及生态环境[2]。湿式过氧化氢催化氧化法是目前较为行之有效的酚类有机废水处理方法[3−4]。其中，湿式过氧化氢氧化反应催化剂——羟基硝酸铜[Cu2(OH)3NO3]的主要合成方法有Cu(NO3)2与NaOH 溶液反应沉淀法[5]、Cu(NO3)2与尿素水解法[6]、Cu(NO3)2溶液与CuO 反应法[3]、Cu(NO3)2溶液水热法[7]等。但是，过氧化氢等氧化剂的加入不仅提高了有机废水处理成本，更对环境造成了不可控的影响。因此，开发以空气为氧化剂的污染物降解催化剂是未来高级氧化工艺的重点研究方向。
漆酶作为一种多铜氧化酶，可以实现多胺、多酚类有机物的单电子氧化与氧气的四电子还原[8−9]。因此，漆酶是一种可用于水处理及土壤修复领域的绿色催化剂[10]。然而，漆酶具有催化稳定性差、重复利用性低、成本高等缺点，限制了其环境催化应用。为提高漆酶的重复利用性，科研人员开发出多种漆酶固定化技术[11−13]。虽然酶固定化大大提高了漆酶的重复利用性，但是由于蛋白质在复杂环境下的稳定性较差，天然酶的催化稳定性仍是亟待解决的关键问题。
纳米酶是一种具有酶催化活性的纳米材料，因其具有多功能性、低成本、高稳定性等优点，近年来引起广泛关注[14]。基于多种纳米材料及其衍生物的纳米酶被相继研究报道，如贵金属[15]、金属氧化物[16]和碳基纳米材料[17]等，并被用于病毒检测[18]、重金属离子检测[19]、有机磷化学试剂降解[20]和灭菌[21]等领域。相比天然酶，纳米酶体现出更好的催化稳定性和重复利用性。
本文以尿素水解过程中产生的异氰酸根离子为模板剂，与Cu(NO3)2溶液反应制备具有漆酶活性的多级结构羟基硝酸铜[H−Cu2(OH)3NO3]纳米酶（图1）。相比传统Cu(NO3)2与尿素水解法制备的羟基硝酸铜，其比表面积更大，催化活性更高。通过TEM（透射电子显微镜）、SEM（扫描电子显微镜）、FTIR（傅里叶变换红外光谱）、XPS（X 射线光电子能谱）和XRD（X射线衍射）等表征手段，对其表面结构及内部组成进行研究；
通过漆酶特征反应，考察H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化活性、稳定性、重复利用性；
并考察其氧化降解实际污染物（2,4−二氯苯酚和对苯二酚）的催化效率。此外，通过对照实验与理论分析，研究H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化机理。
图1 多级结构羟基硝酸铜[H−Cu2(OH)3NO3]纳米酶的合成示意图
1.1 实验材料
尿素和Cu(NO3)2·3H2O，天津元立化工有限公司；
2,4−二氯苯酚（2,4−DP）、4−氨基安替吡啉（4−AP）、2−吗啉乙磺酸（MES）、对苯二酚，上海阿拉丁生化科技有限公司；
漆酶（laccase），Sigma−Aldrich。上述试剂均为分析纯，直接用于本实验。
1.2 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶的合成方法
6g 尿素溶于50mL 水中，转移至三颈瓶中，100℃油浴下剧烈搅拌6h。1.32g Cu(NO3)2·3H2O 溶于50mL 水中，逐滴加入尿素溶液中，搅拌10min后，将反应体系转移至烧杯中，常温下搅拌20min后，离心水洗，乙醇洗，60℃干燥。
1.3 表征方法
扫描电子显微镜图像（SEM）由场发射扫描电镜（FESEM，Regulus 8100，日立高科技公司）在4kV加速电压下拍摄。在扫描电镜观察之前，所有样品均使用E1045铂涂层机（日立高科技公司）溅射铂涂层。透射电子显微镜图像（TEM）由场发射透射电子显微镜（JEM−2100F，日本电子） 在200kV加速电压下拍摄。通过紫外可见分光光度计（Agilent Cary 3500，美国）测量紫外光谱数据。通过X 射线衍射仪（Bruker，德国）测量X 射线衍射（XRD）数据，以5°/min从10°扫描到80°。通过装备了单色Al靶源（hν=1486.6eV）的XPS分光仪（Kratos Axis Supra）测量X射线光电子谱（XPS）。
1.4 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶的催化活性
通过酚类物质与4−氨基安替吡啉（4−AP）发生的显色反应，考察H−Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶的催化活性。具体而言，2,4−二氯苯酚（2,4−DP）的水溶液（1mg/mL,100μL）、4−氨基安替吡啉（4−AP）的水溶液（1mg/mL,100μL）和2−吗啉乙磺酸（MES）缓冲溶液（30mmol/L，pH=6.8,700μL）混合，随后向上述混合溶液中分别加入H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的水分散液和漆酶的水溶液（均为1mg/mL,100μL），在25℃下反应1h 后，将反应混合液离心（12000r/min, 3min）分离出纳米酶催化剂，测试上清液在510nm下的吸光度。
1.5 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶的催化动力学常数
不 同 浓 度（10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL 和100μg/mL）的2,4−二氯苯酚与0.15mg/mL的4−氨基安替吡啉（在所有测试中均保持过量）在0.1mg/mL H−Cu2(OH)3NO3纳米酶或漆酶催化下反应，测定反应初始速率。采用米氏方程[式(1)]计算得到动力学常数（Km和vmax）。
式中，v为表观初始反应速率；
Km为米氏常数；
vmax为初始最大反应速率；
[S]为底物浓度。
1.6 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶的催化稳定性和重复利用性
（1）酸碱稳定性测试方法 H−Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶分别在不同pH（3～13）的缓冲溶液中孵化7h，之后再考察其催化活性。相对活性是分别参照H−Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶在pH=7 时的催化活性。
（2）温度稳定性测试方法 H−Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶的水分散液分别置于30～90℃、45min条件下分离出来测试催化活性。以H−Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶在30℃下的催化活性作为参照。
（3）时间稳定性测试方法 H−Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶在常温下分散于水中，每三天测一次催化活性。
（4）盐溶液稳定性测试方法 向上述2,4−二氯苯酚和4−氨基安替吡啉的催化反应体系中加入不同质量的NaCl，使NaCl 终浓度为0mmol/L、150mmol/L、300mmol/L 和500mmol/L，考察其反应1h后的上清液在510nm下的吸光度。
（5）有机溶剂稳定性测试方法 向上述2,4−二氯苯酚和4−氨基安替吡啉的催化反应体系中加入不同量的乙醇（体积分数分别为0、25%、50%、70% 和100%），考察其反应1h 后的上清液在510nm下的吸光度。
以上所有催化活性测试方法均采用2,4−二氯苯酚与4−氨基安替吡啉在室温下反应1h 后，测试其上清液在510nm下的吸光度。
（6）H−Cu2(OH)3NO3纳米酶重复利用性考察方法 2,4−二氯苯酚水溶液（1mg/mL, 100μL）、4−氨基安替吡啉水溶液（1mg/mL, 100μL）、MES缓冲溶液（30mmol/L, pH=6.8, 700μL）、H−Cu2(OH)3NO3纳米酶分散液（1mg/mL, 100μL）在常温下混合反应1h后，离心分离（12000r/min, 3min）水洗，进行下一次催化循环。
1.7 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶催化降解酚类污染物
2,4−二氯苯酚（1mg/mL, 200μL）水溶液和对苯二酚水溶液（1mg/mL, 200μL）分别与MES 缓冲溶 液（30mmol/L, pH=6.8, 1400μL）、 去 离 子 水（200μL）、H−Cu2(OH)3NO3水分散液或漆酶溶液（1mg/mL, 200μL）混合。随后以10mL/min 的速率向反应体系中通入氧气，降解2,4−二氯苯酚与对苯二酚。每次取50μL 离心（12000r/min, 3min）后，采用高效液相色谱分析降解效率。
采用配备紫外检测器（SPD−20A, Japan）的高效液相色谱（Shimadzu, Japan）检测2,4−二氯苯酚和对苯二酚浓度。液相色谱检测方法为C18色谱柱（Zorbax SB−C18, 250mm×4.6mm，i.d. 5μm, Agilent,USA），流动相为甲醇∶水（7∶3，体积比），流速为0.8mL/min，进样量为20μL，检测波长为226nm，柱温箱为40℃，进样前，样品通过0.22μm 滤膜去除不溶物。
2.1 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶的结构表征
H−Cu2(OH)3NO3是一种长条状纳米片（一级结构）[图2(a)]，这种长条状结构可以组装在一起形成纳米团簇状的宏观结构（二级结构）[图2(b)]。该多级结构未见文献报道。
图2 H−Cu2(OH)3NO3的TEM图和SEM图
为进一步研究H−Cu2(OH)3NO3中的化学键，H−Cu2(OH)3NO3的FTIR 红 外 光 谱 如 图3(a)所 示。H−Cu2(OH)3NO3在3532cm-1处的伸缩振动表明OH−的存在；
在1415cm-1、1385cm-1、1342cm-1处的三重峰为Cu2(OH)3NO3的特征峰，且与相关文献报道一致[6,22]；
在2198cm-1处的峰表明存在异氰酸根，与传统尿素法合成的Cu2(OH)3NO3材料[6]不同。因为尿素分解产生氨气和异氰酸，异氰酸在酸性和中性条件下分解为CO2，在碱性条件下生成异氰酸根[6]。传统尿素合成法将尿素与硝酸铜混合后加热，制备片层状的Cu2(OH)3NO3，因为硝酸铜的加入会使体系处于中性，所以异氰酸分解为CO2。而本文先使尿素在100℃下分解6h，产生的氨气溶于水，体系为碱性，从而使异氰酸充分分解为异氰酸根，随后逐滴加入硝酸铜制备多级结构的H−Cu2(OH)3NO3。综上所述，推测异氰酸根的存在促进了多级结构的产生。证明尿素分解模板法与传统尿素法的最大区别在于充分利用模板剂异氰酸根的结构调控作用。
H−Cu2(OH)3NO3的XRD 如 图3(b)所 示，与Cu2(OH)3NO3的标准XRD 卡片完全对应，证明H−Cu2(OH)3NO3的成功合成。
XPS用于分析H−Cu2(OH)3NO3中Cu元素的价态及元素分布。精细XPS 能谱数据如图3(c)所示，933.6eV 和953.4eV 的峰分别属于Cu2+的Cu 2p3/2和Cu 2p1/2电子。结合能较低的931.7eV（2p3/2）和951.4eV（2p1/2）证明存在Cu+或Cu0。为进一步分析H−Cu2(OH)3NO3中Cu 元素价态，Cu LMM 俄歇谱如图3(d)所示，574.6eV 的峰表明存在Cu+；
569.2eV的峰表明存在Cu2+，且Cu+约占13.4%，Cu2+约占86.6%。
图3 H−Cu2(OH)3NO3的结构表征
2.2 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化活性
采用文献[23]报道的酚类化合物与4−氨基安替吡啉（4−AP）发生显色反应来考察H−Cu2(OH)3NO3和漆酶的催化活性。2,4−二氯苯酚（2,4−DP）在反应中被氧化，4−氨基安替吡啉与其氧化产物结合形成红色的产物，相关物质的结构式如图4(a)所示。H−Cu2(OH)3NO3在不同pH 下的催化活性，如图4(b)所示。在pH=6 和6.8 时，H−Cu2(OH)3NO3具有较高的催化活性。因此，选择在接近中性（pH=6.8）的条件下考察其催化活性。
为考察多级结构对Cu2(OH)3NO3催化性能的影响，在相同质量浓度下测定H−Cu2(OH)3NO3和传统尿素法合成的Cu2(OH)3NO3催化2,4−二氯苯酚和4−氨基安替吡啉显色反应的吸光度。结果表明，H−Cu2(OH)3NO3催化反应的吸光度是传统Cu2(OH)3NO3催化反应吸光度的1.85倍[图4(c)]，证明H−Cu2(OH)3NO3的多级结构增大了比表面积，暴露出更多的活性位点，从而显著增强其催化活性。
图4 H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化活性
通过调整底物浓度测定H−Cu2(OH)3NO3和漆酶的反应动力学参数，研究H−Cu2(OH)3NO3的催化动力学特性（图5）。并通过米氏方程得到Km和vmax，如表1 所示。相比漆酶，H−Cu2(OH)3NO3具有更高的vmax值，说明其具有更高的反应速率。但是其Km值较大，说明H−Cu2(OH)3NO3的底物亲和力低于漆酶。这可能与其刚性结构对底物的亲和力弱于漆酶动态蛋白质结构对底物的诱导契合效应有关。
图5 H−Cu2(OH)3NO3和漆酶室温下催化2,4−二氯苯酚（2,4−DP）和4−氨基安替吡啉反应的Lineweaver−Burk图
表1 常温下H-Cu2(OH)3NO3和漆酶催化2,4-二氯苯酚和4-氨基安替吡啉反应的动力学常数
2.3 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化稳定性和重复利用性
在酶催化剂的实际应用中，稳定性和重复利用性同样至关重要。因此，研究H−Cu2(OH)3NO3纳米酶在不同pH、温度、储存时间、离子强度、乙醇溶剂中催化2,4−二氯苯酚与4−氨基安替吡啉显色反应的稳定性和重复利用性。
H−Cu2(OH)3NO3纳米酶和漆酶分别在不同pH（3～13）的缓冲溶液中孵化7h 后，测试其在pH 为6.8的MES缓冲溶液中催化2,4−二氯苯酚和4−氨基安替吡啉反应的活性，数据如图6(a)所示。酸性和碱性条件对漆酶的稳定性均有显著影响，而H−Cu2(OH)3NO3在pH=5～10 的范围内体现出良好的稳定性，当pH<5时，H−Cu2(OH)3NO3会溶解于酸性溶液中；
当pH>10 时，会转变为Cu(OH)2，从而造成催化活性的急剧降低。
H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的温度稳定性如图6(b)所示。在30～90℃的温度下储存45min 后，漆酶的催化活性从50℃开始逐渐降低，在80℃下完全失活。而H−Cu2(OH)3NO3纳米酶也是从50℃开始逐渐降低，在90℃的极端条件下仍能保持50%以上的催化活性。说明相比漆酶，H−Cu2(OH)3NO3具有更好的温度稳定性。
如图6(c)所示，漆酶催化活性随其在水中储存时间的延长而逐渐降低，12d 后完全失活。但是，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶在水中常温储存18d 后仍保持65.2%的催化活性。表明H−Cu2(OH)3NO3纳米酶在水中表现出较强的稳定性。
图6 相同质量浓度下H−Cu2(OH)3NO3和漆酶在不同pH、温度、储存时间、NaCl浓度、乙醇等条件下的催化稳定性及H−Cu2(OH)3NO3的重复利用性
如图6(d)所示，随着NaCl浓度增大，漆酶的催化活性急剧降低；
而H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化活性反而提高到原来的190%，可能是由于NaCl的存在促进了底物2,4−二氯苯酚在H−Cu2(OH)3NO3纳米酶表面的吸附，从而极大地提高了催化活性。
为研究有机溶剂对催化活性的影响，将不同含量（0、25%、50%、70%和100%，体积分数）的乙醇与反应物溶液混合。如图6(e)所示，随着乙醇含量的增大，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶与漆酶的催化活性都在逐渐降低。当乙醇的体积分数为100%时，H−Cu2(OH)3NO3和漆酶均完全失活，向反应体系中通入氧气，也未观察到催化活性，表明乙醇溶液的存在会阻碍反应的进行。
为考察H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的重复利用性，将2,4−二氯苯酚和4−氨基安替吡啉与H−Cu2(OH)3NO3纳米酶在MES 缓冲溶液中反应1h 后，离心分离，水洗后进入下一个反应循环。如图6(f)所示，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶在经历了12 次催化循环后，仍保持58%的催化活性。因此，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶在不同pH、温度、储存时间、离子强度、乙醇溶剂中均体现出优于漆酶的催化稳定性和良好的重复利用性。
2.4 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶催化降解酚类污染物
为了进一步研究H−Cu2(OH)3NO3纳米酶对酚类污染物的降解能力，分别选择2,4−二氯苯酚和对苯二酚作为氯酚和双酚的模式底物。如图7(a)所示，相比漆酶，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶对2,4−二氯苯酚体现更高的降解活性。如图7(b)所示，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶降解对苯二酚的最终反应效率（42%）高于漆酶（31.5%）。但是，漆酶氧化对苯二酚的初始反应速率更快，这可能与漆酶具有更大的底物亲和力有关。此外，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶对土壤与地下水中常见的2,6−二甲氧基苯酚和邻氨基苯酚污染物的降解效率如图8所示。在215min时，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶对2,6−二甲氧基苯酚污染物的降解效率为87.8%，高于漆酶的降解效率[58.5%，图8(a)]。反应7.7h 后，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶对邻氨基苯酚污染物的降解效率为69.6%，高于漆酶的降解效率[55.9%，图8(b)]。因此，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶具有降解土壤与地下水中酚类污染物的能力，且其降解效率接近甚至优于漆酶。
图7 H−Cu2(OH)3NO3与漆酶催化降解2,4−二氯苯酚和对苯二酚的反应转化率
图8 H−Cu2(OH)3NO3与漆酶催化降解2,6−二甲氧基苯酚和邻氨基苯酚的反应转化率
2.5 H-Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化机理
Solomon 等[24−25]深入研究了漆酶等多酚氧化酶的催化机理。具体而言，多酚氧化酶CuⅡ耦合的双核活性中心先与酚类底物结合，氧化底物，生成醌类物质，CuⅡ得到电子转变为CuⅠ耦合的双核中心；
随后，氧气分子与CuⅠ耦合的双核中心结合，形成含氧配体的双CuⅠ耦合结构；
最后，氧气得到CuⅠ的电子还原为水，CuⅠ被氧化为CuⅡ，实现酶催化循环。
受此催化机理的启发，本文提出了H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化机理。如图9所示，主要包括：① 酚类底物的结合；
② 底物在双CuⅡ耦合活性中心的氧化，伴随CuⅡ被还原为CuⅠ；
③ 氧气分子与双CuⅠ耦合中心结合，形成含氧配体的双CuⅠ耦合结构；
④ 氧气得到CuⅠ的电子还原为水，伴随CuⅠ被氧化为CuⅡ，实现H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化循环。为了使催化机理简明易懂，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的活性中心简化为O−Cu配位结构。
图9 H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化机理示意图
本文以尿素分解产生的异氰酸根为模板剂成功制备了具有漆酶催化活性的多级结构H−Cu2(OH)3NO3纳米酶，并用于酚类污染物的氧化降解。主要结论如下。
（1）H−Cu2(OH)3NO3纳米团簇（1～2μm）由长条状纳米片（500～900nm）构成，其多级结构主要与模板剂异氰酸根有关。
（2）H−Cu2(OH)3NO3纳米酶的催化活性是传统规整结构Cu2(OH)3NO3的1.85 倍，其最大反应速率是漆酶的1.27倍。在pH=5～10的体系中孵化7h后，仍能保持90%以上的催化活性。在90℃的条件下保存45min 或在水溶液中储存18d 后仍能保持50%～66%的催化活性。重复利用12 次后，保持58%的催化活性。因此，H−Cu2(OH)3NO3纳米酶具有良好的催化稳定性和重复利用性。
（3）H−Cu2(OH)3NO3纳米酶具有降解土壤与地下水中常见的2,4−二氯苯酚、对苯二酚、2,6−二甲氧基苯酚和邻氨基苯酚等酚类污染物的能力，且其降解效率接近甚至优于漆酶。
猜你喜欢漆酶二氯苯酚一种苯酚焦油中苯酚与苯乙酮的回收方法能源化工(2021年6期)2021-12-30毛细管气相色谱法测定3-氟-4-溴苯酚云南化工(2020年11期)2021-01-14亚洲将引领全球苯酚产能增长合成技术及应用(2021年1期)2021-01-07气相色谱-质谱联用法检测血液中的1，2-二氯丙烷灾害医学与救援(电子版)(2018年1期)2018-06-05回收制备二氯二氨合钯(Ⅱ)前驱体材料的工艺研究中国资源综合利用(2017年4期)2018-01-22以竹粉为基质固态培养虫拟蜡菌及其产漆酶条件研究安徽农学通报(2017年8期)2017-05-12煅烧高岭土吸附Zn2＋/苯酚/CTAB复合污染物的研究天津城建大学学报(2015年5期)2015-12-09内含双二氯均三嗪基团的真丝织物抗皱剂的合成浙江理工大学学报(自然科学版)(2015年5期)2015-03-01青霉菌产漆酶的研究及在木质素降解中的应用湖北农业科学(2014年10期)2014-09-22香灰菌传代对银耳栽培的影响江苏农业科学(2014年4期)2014-07-11
