梁诚 牛纪平 满江位 杨立
缺血-再灌注损伤、排斥反应和间质纤维化是造成移植肾微血管损伤的主要病因。管周毛细血管（peritubular capillary，PTC）是肾小管的主要滋养血管，且再生能力较低，其损伤和数量减少会影响肾小管的功能，并导致肾脏慢性缺氧和间质纤维化，最终引起移植肾失功[1]。研究发现，以PTC为靶点，通过维持其结构和功能的完整性可以减轻缺血-再灌注损伤，并抑制肾脏间质纤维化的进展[2]。此外，PTC损伤后的炎症改变还可为移植肾排斥反应提供诊断和预后的关键信息[3]。因此，了解肾移植过程中PTC的损伤机制和损伤后特异性改变，对于诊治肾移植术后并发症，改善肾移植受者的长期预后，具有十分重要的意义。
肾小管周围毛细血管网是肾脏微循环网络的重要组成部分，主要包括皮质肾小管周围毛细血管和髓质小血管，它们包绕在肾小管结构的周围，参与肾小管的能量代谢、重吸收和物质分泌等重要过程[4]。管周毛细血管内皮细胞（peritubular capillary endothelial cell，PTCE）是PTC的主要功能细胞，与人体普通内皮细胞相比，其表面存在大量窗孔结构，增加了血管通透面积，对调节肾间质的物质交换具有重要作用[5]。与肾小球毛细血管内皮细胞不同，PTC窗孔处还覆盖有一层由多个放射状纤维和糖胺聚糖组成的质膜状结构，为窗孔提供强大的分子筛选功能。研究发现，当小鼠质膜囊泡相关蛋白（plasmalemma vesicleassociated protein，PLVAP）生成障碍时，可引起质膜形成障碍和内皮窗孔数量减少，表现为肾脏血供障碍和广泛水肿[6]。参与PTCE稳态的另一个重要结构是糖萼，这是一种由蛋白聚糖和糖胺聚糖组成并覆盖于内皮细胞表面的凝胶状结构，具有阻止血液凝固、炎症细胞黏附和调节血管舒缩功能的作用[7]。周细胞是嵌入PTC基膜并附着于内皮细胞上的一种间充质来源细胞，作为支持细胞参与维持PTC结构和功能稳定。现有的研究表明，周细胞可分泌血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、促血管生成素（angiopoietin，Ang）1调节内皮细胞存活和血管生成过程，同时周细胞衍生的血管紧张素可以作为一种自分泌信号调节微循环张力[8]。应用基因敲除技术构建肾脏周细胞缺失鼠模型发现，PTCE肿胀且数量显著减少，同时管腔明显扩张，提示缺乏周细胞后PTC的功能进一步降低。肾移植围手术期相关缺血-再灌注损伤、排斥反应会直接损伤PTCE的结构，影响PTC的稳态，造成PTC数量减少，导致移植肾出现不可逆的功能减退[9]。
缺血-再灌注损伤是肾移植不可避免的阶段，内皮细胞具有生物力学传感特性，可最先感知缺血-再灌注过程中的血流动力学变化并发生广泛的损伤适应过程。内皮糖萼是覆盖在血管腔表面的一层多糖-蛋白质复合物，具有机械转导作用。当血流变化时，内皮糖萼可以感应流体剪切力变化，并将信号传递给内皮细胞，启动内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）/一氧化氮（nitric oxide，NO）信号通路介导的血管舒张，改善微循环灌注[10]。缺血-再灌注可引起基质金属蛋白酶系统的酶解和氧化应激途径的非酶促反应激活并切割糖萼有效成分，导致其脱落，破坏内皮依赖性舒张功能和结构完整性[11]。器官常温机械灌注系统可以最大限度地模拟体内灌注环境，维持内皮细胞表面流体剪切力恒定并减少实际缺血时间，为体外评估和修复器官提供了良好的平台[12]。通过添加糖萼降解系统的拮抗剂或再生糖萼成分以优化灌注液，可在防止器官保存期间糖萼脱落的同时促进其再生，改善微循环灌注效果，为保存并修复边缘器官提供了潜在的方法[12]。
细胞外囊泡是细胞释放的一种膜泡状结构，通过被靶细胞吸收，参与细胞间信号调控过程。当发生再灌注损伤时，凋亡的内皮细胞会产生凋亡小体和囊泡，进一步传递细胞死亡信号[13]。值得注意的是，一些研究发现，具有干细胞特性细胞释放的外囊泡通过下调内皮细胞PTEN基因表达和激活磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，Akt）通路，调控再灌注后内皮细胞凋亡的过程，增加内皮系统对缺血-再灌注的耐受性[14]。因此，调控PTCE凋亡信号通路有望成为细胞疗法治疗缺血-再灌注损伤的潜在靶点。
随着缺血时间延长，大量内皮细胞凋亡引起内皮屏障和细胞间连接破坏，血管内物质外渗造成间质水肿，影响微循环灌注[15]。同时，内皮系统正常结构的破坏还将上调促炎表型和促凝表型，导致PTC炎症细胞浸润和微循环血栓形成[16]。以中性粒细胞参与为主的无菌性炎症在肾缺血-再灌注后微血管损伤进展中发挥重要作用。中性粒细胞是早期响应于损伤信号到达损伤部位的炎症细胞，借助多光子活体成像技术可以在时空维度研究这一过程。Maruyama等[17]发现，再灌注数分钟后，缺血期间汇聚的中性粒细胞从肾小球逐渐滚动并黏附到损伤的肾小管和PTC周围，这种现象在缺血-再灌注后长达24 h的观察期内持续存在。早期大量浸润的中性粒细胞响应组织细胞损伤后释放的炎症介质而活化。损伤相关分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）是一类由损伤细胞释放的内源性分子，通过与模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）如Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）结合，诱导中性粒细胞激活并释放中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular trap，NET），加重缺血-再灌注后的微循环障碍[18]。NET形成还参与微循环凝血过程，其组蛋白成分可通过TLR2和TLR4活化血小板；
弹力蛋白酶可消耗抗凝物质如抗凝血酶Ⅲ、组织因子途径抑制剂；
特殊的网状结构可作为支架，激活内外源性凝血途径并抑制血栓降解，诱发高凝状态和局部微血栓形成[19]。凝血途径激活加重血管功能障碍，导致局部长时间的缺血缺氧，进而损害肾小管细胞的修复和再生。应用特异性抑制剂肽酰基精氨酸脱亚氨酶（peptidylarginine deiminase，PAD）4可有效阻断NET的形成或脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）Ⅰ促进其网状结构降解，将有望成为改善缺血-再灌注后微循环障碍的治疗靶点。灌注损伤、内皮细胞凋亡以及炎症细胞浸润是肾缺血-再灌注损伤的重要机制，通过维持PTC的正常结构和功能，促进PTC损伤后再修复，抑制其炎症表型上调，将成为减轻肾缺血-再灌注损伤新的有效策略。
肾移植术后，由于移植肾内皮系统直接暴露于受者的免疫系统，因此当发生排斥反应时，移植肾的血管系统特别是PTC系统最容易免疫损伤，其特异性改变已经成为判断排斥反应类型和评估预后的重要依据。依据发病机制，排斥反应可分为细胞介导的排斥反应（cell-mediated rejection，CMR）和抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR），不同的排斥反应类型引起PTC特异性改变。CMR是以T细胞为主导，多种免疫细胞、炎症细胞和细胞因子共同参与的排斥反应，也是最常见的急性排斥反应类型[20]，多光子共聚焦显微镜为研究这种复杂的免疫过程提供了一种可视化工具。国外有学者将组织中的免疫细胞进行特定荧光标记，动态展示组织内T细胞的空间迁移过程。分布在PTC周围的树突状细胞作为主要的抗原提呈细胞，通过与T细胞稳定结合，介导T细胞的跨内皮迁移和后续的间质损伤过程[21]。此外，研究微循环的免疫细胞浸润特点可以有效区分排斥反应的类型和预后。Yazdani等[22]通过对不同排斥类型的移植物样本进行转录组学分析，证明活化的自然杀伤（natural killer，NK）细胞是区分AMR和CMR并与移植结果相关的关键细胞亚群。组织学评估是诊断移植物排斥反应的重要手段，在研究组织炎症细胞浸润时，病理学家通常需要进行连续组织切片和分类免疫组织化学染色，这将不可避免地影响观察者对细胞间相互作用和细胞位置的精确判断。多重免疫荧光技术能够在一张切片上同时检测多种免疫细胞亚群，可以很好展现组织中的炎症负荷。通过对PTC内外的免疫细胞进行聚类分析，可以为转录组学数据分析提供有效补充[23]。免疫细胞浸润介导了生物体内的多种疾病过程，近年来已经在肿瘤微环境中得到广泛的研究，多项研究已经证实微循环炎症细胞浸润与排斥反应的类型和预后相关，未来应用先进的体内成像技术和免疫组织化学技术，结合多组学的数据分析来研究移植物免疫细胞浸润过程还将会成为移植免疫的热点研究方向。
随着对CMR的有效控制，AMR已成为预防和诊治排斥反应的核心，并影响移植肾的短期存活率和长期预后。AMR是由于血管内皮上的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子、ABO抗原和血管内皮细胞其他抗原诱导供者特异性抗体（donor specific antibody，DSA）产生，并发生微血管炎症（肾小球炎和肾小管周围毛细血管炎）以及肾小管周围毛细血管中补体片段沉积[24]。DSA可通过补体激活、抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-medicated cytotoxicity，ADCC）和内皮激活的相互作用导致微血管损伤。当DSA与内皮细胞表面分子结合时，它们可以激活补体引起损伤。补体系统激活后，其降解片段如C3d、C4d可以共价结合到细胞表面，并可以作为补体激活的标志物，在一定程度上反映排斥反应的程度和预后[25]。AMR还涉及非补体依赖性途径，尤其是中性粒细胞、巨噬细胞和NK细胞介导的ADCC，通过释放穿孔素和颗粒酶以及趋化因子诱导内皮细胞快速凋亡或裂解[26]。除了补体依赖机制和ADCC，DSA还可以直接激活移植物内皮系统。DSA结合上调黏附分子如血管细胞黏附分子（vascular cellular adhesion molecule，VCAM）-1、细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）-1、P-选择素在移植物内皮细胞表达，从而增强血小板和白细胞募集和黏附，加剧毛细血管炎，导致微血栓形成[27]。尽管自2003年以来，PTC中C4d的免疫组织化学染色一直是AMR诊断中的重要项目，但其灵敏度有限，特别是近年来发现在某些病例中未能检测到DSA的存在和明显的微血管炎症，这些可能反映了体内更加复杂的排斥反应过程，增加了临床及时诊断和治疗的难度。我国学者发现，与其他状态的移植物相比，AMR组PTC早期存在明显的管腔扩张和数量迅速减少，这些扩张的PTC主要见于炎症区域，同时，还观察到扩张的PTC管腔内T-bet阳性细胞数量可以很好地反映局部血管炎症程度，有望成为AMR潜在的诊断标志物[28]。内皮损伤是AMR的关键环节，当内皮细胞损伤后会引起内皮细胞向上皮表型转化，参与损伤及修复过程，类似于上皮间质转化。Xu-Dubois等[29]最先在53例肾移植活组织检查（活检）标本中发现内皮-间质转化（endothelial to mesenchymal transition，EndMT）的证据，通过在一组独立的样本中进行验证发现其特异性标志物Fascin1、Vimentin和HSP47可以用于诊断AMR，而在早期没有检测到组织学病变的病例中，EndMT标志物表达与随访期间进行性移植物功能障碍和蛋白尿增加有关，这些移植物在后续活检中均发现了AMR的存在[29]。因此，EndMT的分子表达可能提示了排斥反应过程中内皮系统发生的早期适应性改变。随后，Louis等[30]在351份移植物活检样本中对EndMT再次进行验证，与此前研究相一致的是，EndMT可以很好地反映移植物的排斥反应状态，此外，基于EndMT参数的分层分析还将有助于早期识别潜在的高风险受者。应该注意的是，EndMT相关标志物可能不只代表了AMR的发病过程，也可能在其他内皮损伤的过程显著上调，包括缺血-再灌注损伤和纤维化过程，有关于该表型在排斥反应过程中的发病机制和诊断价值仍需要进一步研究。
肾脏纤维化是多种病因引起肾功能出现不可逆性丧失的终末途径，肾小管周围毛细血管网损伤、数量减少以及间质纤维化是这一病理性过程发展的重要阶段。主流的观点认为，内皮和周细胞向成纤维细胞转变、PTC功能障碍以及内皮细胞的表观遗传变化是肾脏纤维化过程中的核心机制。
正常情况下，肾脏间质中仅存在少量的成纤维细胞，但在肾间质纤维化过程中却大大增加。有关于肾脏中肌成纤维细胞的来源一直是过去研究的重点，其中内皮细胞和周细胞向成纤维细胞转化被认为是损伤后肌成纤维细胞的主要来源，其过程类似于上皮-间质转化，设法阻断其纤维化转化过程将成为治疗肾脏纤维化的重要策略。转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）是体内关键的促纤维化通路，通过介导内皮细胞和周细胞的纤维化转变，启动纤维化修复过程[31-32]。响应于损伤后的促纤维化信号激活，周细胞从血管壁分离并转化为肌成纤维细胞，增加间质胶原纤维沉积[33]。体内人骨髓间充质干细胞移植和体外诱导共培养的数据显示，当发生急性肾损伤时，人骨髓间充质干细胞可以通过抑制周细胞解离和转化，同时分化并替代受损的周细胞，维持PTC稳态[34]。当肾损伤发生后，PTCE也可以经历部分EndMT，应用遗传谱系示踪技术可以证明体内这一过程[35]。激活素受体样激酶（activin receptor like kinase，ALK）1属于TGF-β超家族，主要在内皮细胞中表达，参与血管生成。TGF-β与内皮细胞ALK1结合，从而参与血管损伤修复过程。研究发现ALK1杂合性基因敲除鼠中，肾纤维化和微血管稀疏程度较低，其机制可能为早期ALK1水平的降低抑制了内皮细胞的激活和间质转化过程，减少了肌成纤维细胞的产生和细胞外基质沉积[36]。尽管一些研究指出EndMT对肾肌成纤维细胞的作用可能有限[37]，但通过靶向该表型转换的核心介质（如Twist、Snail）阻断EndMT，对维持PTC稳态和肾小管正常代谢过程，阻止慢性肾病进展仍具有重要的治疗意义[35]。
基于3种不同方式诱导的肾脏纤维化模型和移植肾活检样本，国外学者研究了肾脏纤维化过程中微血管超微结构和功能改变。研究发现，无论最初的损伤病因，随着肾脏纤维化的进展，PTCE窗孔数量均逐渐减少，这种超微结构的改变发生在组织学上可检测到的PTC稀疏和肾小管间质纤维化之前[38]，揭示了一种损伤后更早期的病变现象。另一个显著的超微结构改变是PTCE中小窝和囊泡的数量增加，因为小窝负责血浆液体和蛋白质的跨内皮转移，其数量增加将引起PTC的血管通透性改变[38]。借助多光子共聚焦显微镜成像系统，研究者进一步评估了微血管的功能，并发现灌注液外渗的部位主要位于微血管分支处，而通常分叉处血流动力学改变会导致损伤的敏感性增加，这一发现可以作为未来实验中评估微循环损伤和保护PTC效果评价的重要参数[39]。然而，这种成像方式仍然受限于成像深度和广度的影响，无法获取完整的肾脏灌注信息。基于组织切片的荧光微血管成像方法，可以在整体上分析PTC数量、毛细血管管径和面积变化（反映血管灌注状态的指标），可作为基础研究阶段评估PTC功能的有效补充[40]。
表观遗传修饰是体内一种不改变DNA序列情况下发生的基因表达变化过程，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA相互作用和染色质重塑[41-43]。即使最初的微血管损伤因素已经去除，前期暴露于缺血和受者免疫系统的环境仍会导致一些表观遗传变化，这些变化可以解释PTC数量减少和肾脏纤维化的持续进展[44]。同时，相比于组织学评估，基于体液的表观遗传学标志物无创式检测可以为发现潜在的早期移植物损伤和预测移植结果提供新的诊断工具[45]。
在肾移植受者中，再灌注损伤和炎症细胞浸润造成PTC损伤和数量减少，成为急性肾损伤向慢性肾脏病转化的关键环节。先进的显微成像和免疫组织化学检查技术为研究急性肾损伤后微循环结构和功能变化提供了有效手段，将这些形态学变化与急性损伤和慢性修复过程联系起来有助于更好地了解肾脏微循环功能状态和评估治疗效果，然而现有的这些有创评估方式可能尚不适用于临床转化，未来还需要开发无创手段来评估肾脏的微循环状态。除了形态学和功能改变，研究PTC稳态所涉及的调控方式、细胞间相互作用和细胞内信号传导还可为移植肾相关疾病提供重要的诊断和预后信息，并有助于发现更多新的治疗靶点。
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