汪春江， 黄永鹏， 唐 慧， 李昇原,2， 陈 博
(1. 国民核生化灾害防护国家重点实验室， 北京 102205；
2. 四川轻化工大学 机械工程学院， 四川 宜宾 644000)
奥曲肽(octreotide，OCT)是由8个氨基酸组成的环状多肽化合物，是首个人工合成的生长抑素类药物，对生长激素、 胰岛素等分泌具有选择性抑制作用[1]，目前是治疗肢端肥大症的首选药物，同时在治疗急慢性胰腺炎、 消化道内分泌肿瘤等领域应用广泛[2-3]。OCT通常需要长期用药，主要的制剂形式为静脉或皮下注射剂，容易对细胞组织造成伤害并引发感染， 因此，对非侵入性的新型给药方式及其制剂需求迫切。
干粉吸入剂(dry powder inhalation，DPI)是利用吸入装置与患者呼吸的气流相作用，将微粉化药物递送至肺部以发挥局部或全身性治疗作用的制剂形式[4-5]，具有方便携带、 操作简单、 剂量准确、 稳定性好、 患者依从性高等优点，且肺泡和毛细管区域吸收面积大， 血流丰富， 交换距离短， 酶降解作用弱，特别适用于OCT等多肽药物[6-7]。本课题组研究证明，以微粉形式吸入OCT能够实现与短效皮下注射几乎相同的生物利用度[8]。药物递送和释放是DPI研究的核心问题，一般要求微粉制剂的空气动力学粒径小于5 μm且具有良好的流动性。由于多肽药物普遍半衰期较短，因此药物释放上要求制剂能够有效延长药物作用时间， 降低给药频率， 减弱毒副作用[9-10]。
介孔二氧化硅(mesoporous silica， MS)具有生物相容性好、 微观形貌多样且可控、 比表面积与比孔容大、 空气动力学性能优越、 装载药物结合力强等优点[11-14]， 理论上是用于DPI的理想载体材料， 兼具优异的递送和释放性能， 但目前尚未发现MS材料负载多肽药物发挥吸入并延长药物作用时间的文献报道。
本文中拟采用溶胶-凝胶工艺制备4种不同的MS材料，通过浸渍吸附-冷冻干燥工艺负载模型药物OCT构建可吸入微粉制剂，并对载体及微粉制剂开展微观形貌、 物相结构、 粒度分布、 载药量、 体外释放性能以及体外吸入沉积等性能评价，为设计OCT及其他多肽药物的干粉吸入制剂提供研究基础。
1.1 材料与仪器
实验材料有奥曲肽， 纯度99.1%(质量分数)， 浙江湃肽生物有限公司生产(批号为2018053003-1)；
吸入α-乳糖(粒径为74 μm)、 氯化钠、 硅酸钠(模数为3.5)、 十二烷基苯磺酸钠(sodium dodecyl benzene sulfonate, SDBS)， 均为分析纯， 北京化工厂生产；
乙二酸、 正硅酸乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)，均为分析纯，美国默克公司生产；
乙醇、 正己烷、 乙腈、 高氯酸、 硫酸、 盐酸均为分析纯，氨水的质量分数为25%，北京试剂厂生产；
超纯水，实验室自制。
主要仪器设备有LGJ-18S型真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)、 3H-2000PS2型比表面积及孔径分析仪(贝士德仪器科技(北京)有限公司)、 ZS90型纳米粒度电位仪(英国马尔文仪器有限公司)、 SU8020型扫描电子显微镜(日本日立公司)、 Tecnai G2型场发射透射电子显微镜(美国FEI公司)、 D8-ADVANCE型X射线衍射仪(德国布鲁克公司)、 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)以及JMT-3型安德森级联撞击器(北京明杰蓝天科技有限公司)。
1.2 介孔二氧化硅的制备
采用溶胶-凝胶工艺，通过改变反应条件，分别制备粒径为厘米级、 微米级和纳米级的MS气凝胶颗粒材料，具体方法如下所示。
块状气凝胶(MS1)：按照物质的量比为1∶4∶5∶0.2的比例混合TEOS、 乙醇、 乙二酸和氨水溶液，在温度为30 ℃条件下水浴搅拌12 h；
搅拌结束后逐滴滴加氨水，待溶液中形成凝胶后的36 h内用乙醇交换凝胶中的水，重复3次；
再用正己烷交换凝胶中的乙醇，重复3次后干燥至恒重。
微米级气凝胶(MS2)：将37.5 mL TEOS、 250 mL乙醇与100 mL超纯水混合均匀后用盐酸调节pH至2～3；
搅拌2 h后用浓氨水调节混合溶液的pH至9～10；
取10 mL溶液静置，在形成透明凝胶后，加入10 mL TEOS和90 mL乙醇的混合溶液，反应48 h；
将溶液预冻后，真空冷冻干燥。
纳米级微球气凝胶(MS3)：将40 mL浓氨水和400 mL乙醇混合均匀后水浴加热至温度为35～40 ℃；
将20 mL TEOS和200 mL乙醇混合均匀，取3/4的TEOS乙醇溶液滴加至氨水-乙醇混合溶液，剧烈搅拌30 min；
滴加余下1/4的TEOS溶液，在温度为60 ℃条件下反应2 h；
待体系冷却至室温后，静置陈化3 h后过滤洗涤干燥至恒重。
纳米级颗粒气凝胶(MS4)：将100 mL硅酸钠溶液(摩尔浓度为0.4 mol/L)加热至温度为70 ℃后加入5 mL氯化钠溶液(质量分数为20%)和0.4 g SDBS；
在搅拌下滴加稀硫酸至溶液出现大量絮状沉淀；
在温度为70 ℃条件下静置陈化0.5 h后过滤洗涤干燥至恒重。
1.3 奥曲肽的负载
将制备的MS载体材料置入温度为120 ℃烘箱活化2 h；
配制质量浓度为50 g/L的OCT水溶液， 按照载体与OCT的质量比为1∶2的条件向溶液中加入载体， 在转速为1 000 r/min的条件下持续吸附24 h；
过滤OCT溶液与MS的混合物， 分离固体进行冷冻干燥。
1.4 性能研究
1.4.1 OCT定量分析
采用高效液相色谱法对OCT进行定量分析，具体实验条件如下：色谱柱(安捷伦Eclipse plus C18)的尺寸为φ4.6 mm×250 mm (直径×长度)、色谱柱内填料间的孔径为5 μm，流动相为乙腈与质量分数为0.25%的高氯酸水溶液的混合液(体积比为30∶70)，进样量为5 μL，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm；
柱温为25 ℃[15]。
1.4.2 理化性能
采用X射线衍射仪对载体进行物相结构表征，操作电压为40 kV，操作电流为40 mA，Cu靶，波长为1.540 6 Å，扫描区域为10°～90°，扫描速率为6(°)/min。
采用扫描电子显微镜和场发射透射电子显微镜表征载体和制剂的微观形貌，扫描电镜操作电压为3～5 kV，放大倍数为200～25 000；
透射电镜操作电压为200～300 kV，放大倍数为1 000～150 000。
采用比表面积及孔径分析仪测定载体的比表面积与孔径，操作过程中选择氮气作为吸附质，设定脱气温度为300 ℃，脱气时间为2 h。
采用纳米粒度电位仪测量Zeta电势，选择水为分散介质。
1.4.3 载药量分析
精密称取适量的微粉制剂置于烧杯中， 加入适量的超纯水；
以500 r/min的转速搅拌6 h， 超声20 min， 将药物充分溶解；
吸取清液过滤后，采用高效液相色谱法进行定量分析，根据质量换算得出载药量(微粉制剂中OCT的质量分数，w)。
1.4.4 体外释放性能
参照文献[16]， 以温度为(37±0.5) ℃的水作为溶出介质， 取适量微粉制剂装进透析袋中， 注水至充盈以保证微粉制剂能够完全润湿；
两端扎紧后浸没于100 mL水中， 在温度为37 ℃、 转速为100 r/min条件下搅拌， 分别在搅拌1、 5、 10、 30、 60、 120、 240、 360、 720、 1 440 min时对溶出介质进行采样并补充置换同体积、 同温度的水；
通过高效液相色谱法对样品进行定量分析，药物累计溶出度Q的计算公式为
(1)
式中：Ci、Cn分别为第i次和第n次取样时的质量浓度，i=1，2，…,n， g/L；
m为微粉制剂的质量， mg；
w为载药量，%；
V1为各时刻的取样体积， mL；
V2为溶出介质的体积，mL。
1.4.5 体外吸入性能
参照文献[16]，采用安德森级联撞击器(ACI)测定微粉制剂的排空率Ed和有效部位沉积率FP，安德森级联撞击器示意图如图1所示。Ed和FP是指在气流作用下，微粉从吸入装置和胶囊中排出以及在肺部有效部位实现沉积的能力，是评价微粉制剂体外吸入性能的关键指标。ACI的第0—8级分离层模拟人体的下呼吸道，当气流流速为28.3 L/min时，第0—8级分离层的空气动力学截止直径分别为9.0、 5.8、 4.7、 3.3、 2.1、 1.1、 0.70、 0.43、 0.22 μm。ACI的第9级为预分离器，第10级为连接吸入装置和ACI的L型管，第11级为吸入装置。
图1 安德森级联撞击器示意图Fig.1 Schematic of anderson cascade impactor
将微粉制剂根据载药量混入适量的乳糖，混合均匀后将样品装载于胶囊中；
称取10粒胶囊置于吸入器后连接ACI；
刺破胶囊后以28.3 L/min的气流流速抽吸8 s，间隔1 s后复吸8 s，重复3次后停止；
用纯水溶解回收留在各级的微粉制剂，定容后通过HPLC进行定量分析。计算公式为
(2)
(3)
(4)
式中：R为药物回收率，%；
Vi为ACI中第i(i=0, 1, …, 11)级OCT的体积， mL。
当R值为95%～105%时， 通过式(3)、 (4)分别计算Ed和Fp。
2.1 介孔二氧化硅载体的表征和物理性能
4种介孔二氧化硅载体的的XRD图谱和SEM图像如图2、 3所示， 物理性能如表1所示。
结果表明：
4种孔二氧化硅载体材料的XRD图谱中均无晶体衍射峰， 且在2θ约为22 °处出现1个强峰， 说明是具有无定形结构的二氧化硅。
MS1为平均粒径为1.8 cm的淡蓝色块状固体， MS1由25 nm的单元颗粒组成， 单元颗粒间平整地聚集连接但中间存在缝隙， 这样的结构让MS1虽然具有较大的粒径， 但仍具有较大的比表面积和和比孔容；
MS2是白色粉末状固体， 由具有立体网状结构的、 平均粒径为34 μm的无规则小块组成， 网状结构让MS2具有在4种材料中最大的比表面积和比孔容；
MS3是由粒径约为100 nm的微球组成的白色粉末状固体， 微球表面粗糙， 微球中存在明显的孔道结构；
MS4则是由粒径为34 nm的小颗粒组成的白色粉末状固体， 小颗粒相互连接聚集， MS4无明显孔道结构；
孔道结构使得MS3比MS4具有了更大的比表面积和比孔容。
图2 4种介孔二氧化硅载体的XRD图谱Fig 2 XRD patterns of four kinds of mesoporous silica carriers
(a)MS1的宏观形貌(b)MS1(放大100 000倍)(c)MS2(放大200倍)(d)MS2(放大100 000倍)(e)MS3(放大100 000倍)(f)MS3(放大100 000倍)(g)MS4(放大100 000倍)(h)MS4(放大100 000倍)图3 4种介孔二氧化硅载体的SEM图像Fig.3 SEM images of four kinds of mesoporous silica carriers
表1 4种介孔二氧化硅载体的物理性能
2.2 微粉制剂的表征和载药量
负载药物的过程中，淡蓝色的大块材料MS1在OCT溶液中逐渐溶蚀分散，形成乳白色悬浮液；
MS2在吸附过程刚开始时，漂浮在溶液表面，但随着搅拌时间的增加逐渐分散于溶液中；
MS3和MS4在OCT溶液中分散速度较快且分散良好。将MS1、 MS2、 MS3、 MS4材料制备的微粉制剂分别记为P1、 P2、 P3、 P4，冷冻干燥后得到的所有微粉制剂均为白色粉末。4种微粉制剂的微观形貌如图4所示。由图可见，MS1载药后原有的结构发生改变，单元颗粒无规则地聚集在一起，颗粒之间仍存在空隙；
MS2载药后，原有的立体网状结构被填充，并部分形成了片状结构；
MS3与MS4载药前后变化不大，MS3载药后仍然保持了原有的规则形貌，MS4载药后的空隙部分明显减少，小颗粒间存在团聚现象。
(a) P1(b)P2(c)P3(d)P4图4 4种微粉制剂的SEM图像Fig.4 SEM images of four kinds of micropowder pharmacies
4种微粉制剂的载药量如图5所示。由图可见，制剂P1、 P2和P4的载药量均大于30%，其中比孔容最大且Zeta电势为负值的载体材料MS2制备的微粉制剂P2的载药量最高，达到了36%；
制剂P3的载药量最低为13%，可能是由于载体材料MS3的Zeta电势为正值，与OCT产生电荷排斥作用而导致载药量偏低。4种载体均实现了对药物的有效装载，这是因为，OCT水溶液的Zeta电势为正值，Zeta电势为负值的载体材料容易通过电荷的相互作用而吸引在一起；
除载体材料的孔道以外，材料的颗粒与颗粒之间形成的缝隙以及材料颗粒的表面也容易发生吸附；
载体材料在孔道装载、表面吸附和静电作用的共同影响下完成对药物的装载。
图5 4种微粉制剂的载药量Fig.5 Drug loading of fourkinds of micropowder pharmacies
2.3 微粉制剂的体外释放性能
微粉制剂的溶出度随反应时间的变化体现了微粉制剂的体外释放性能。
4种微粉制剂的溶出度随反应时间的变化规律如图6所示。
由图可见， 反应时间为0～10 min时， 载药量高的3种微粉制剂P1、 P2和P4在溶出过程初期的溶出度高于纯OCT， 说明被吸附在载体颗粒间的缝隙和载体颗粒表面的OCT在溶出介质中迅速溶出后， 载体孔道内的OCT可持续缓慢溶出；
反应时间为0～1 440 min时， 制剂P1的溶出曲线与纯OCT的基本一致， 未能延长溶出时间， 制剂P2、 P3和P4延长了溶出时间， 4种材料中粒径最小、 平均孔径最大的载体MS4载药后得到的制剂P4延长药物作用时间的效果最好；
微粉制剂P3的溶出度始终低于纯OCT的，且持续释药时间达24 h， 有效延长了药物作用的时间。
(a)0～10 min(b)0～1 440 min图6 4种微粉制剂的溶出度随反应时间的变化Fig.6 Variation of dissolution of four kinds of micropowder pharmachies with reaction time
2.4 体外吸入性能
微粉制剂的体外吸入性能由有效部位沉积率Fp和排空率Ed来体现。4种微粉制剂的有效部位沉积率和排空率如表2所示。由表可知，4种微粉制剂均有较好的Ed，达到了99%以上。制剂P4的颗粒之间存在团聚导致Fp最低，超过一半的颗粒被截留在了预分离器中，无法实现有效部位的沉积；
制剂P1、 P2和P3的Fp均超过了50%，其中制剂P1的颗粒偏大，仍有小部分单元颗粒留在了预分离器；
制剂P2具有片状结构，在气流下更容易分散，因此具有最高的Fp；
制剂P3保持了载体原有的规则形貌，Fp大于60%， 均匀分布在ACI的0—7级且没有被预分离器截留，有利于药物的传递。
表2 微粉制剂的有效部位沉积率和排空率
本文中制备了4种MS载体材料之后，通过浸渍吸附-冷冻干燥工艺负载药物奥曲肽构建了4种微粉制剂，并对MS载体材料以及微粉制剂进行了理化、 释放以及吸入等性能的研究。
1)4种MS载体材料完成了预期设计，具有不同的形貌、 粒径、 比孔容、 比表面积等性能，能够实现对药物OCT的有效负载。
2)4种微粉制剂中P2的载药量最高，达到了36%；
P3的载药量最低，达到了13%；
P1、 P2、 P4未能保持载体的形貌；
P2、 P3和P4延长了溶出时间；
P2、 P3具有较高的有效部位沉积率，能够满足肺部吸入的递送要求，并能够延长药物作用的时间。
3)单分散介孔二氧化硅微球-OCT微粉制剂(P3)具有最佳的综合性能，排空率达到了100%，有效部位沉积率大于60%，具有良好的吸入性能；
在溶出过程中的溶出速率始终低于纯OCT的且持续释药时间达到24 h，有效延长了药物的作用时间；
保持了载体MS3原有的粒径均一的单分散球形形貌，有利于提高药物转运传递剂量的准确性与重现性。
