邓丽 王楠 雷杰 牛群 吴玲 龚兰 谢贝 王琪 李华 杨瑜 刘志辉 孟繁荣
广州市胸科医院肺部疾病研究所 呼吸疾病国家重点实验室，广州 510095
结核病为一种侵扰人类至少有7 000 年历史的古老疾病，但目前仍为单因致死率最高的传染性疾病，是全球的重大公共卫生问题［1］。结核分枝杆菌耐药性的出现与蔓延，更使人类结核病控制形势雪上加霜，如何提高耐药尤其是耐多药结核病患者的治疗水平，又如何有效阻断其传播，是世界卫生组织（WHO）实现2035 年全球终止结核病目标的棘手难题［2］。明晰其耐药机制，并由此研发抗结核新药与诊断新技术则为解决问题的基础与关键。目前，临床应用的抗结核药物共33 种，其中异烟肼为全杀菌一线抗结核药物［3］；
一旦结核分枝杆菌同时对异烟肼与另一种全杀菌一线抗结核药物利福平耐药，则被介定为低治愈率、高病死率的耐多药结核病［4］。因此，结核分枝杆菌异烟肼耐药倍受人们重视，对其耐药机制的研究也取得了丰硕的成果，目前人们认为结核分枝杆菌过氧化氢-过氧化物酶编码基因katG 和烯酰-酰基载体蛋白还原酶编码基因inhA 基因突变为主要机制，编码烷羟基丙二酸还原酶的ahpC 启动子区（oxyR-ahpC）、编码β-酮酰基载体蛋白合成酶的kasA 基因和编码NADH 脱氢酶的ndh 基因突变也参与其中，但这些基因突变发生频度与其耐药表型的关联性则报道不一［5］。为丰富相关循证医学证据，我们对华南地区236 株异烟肼耐药结核分枝杆菌株和144 株异烟肼敏感结核分枝杆菌株的katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因突变情况进行了分析，现报道如下。
1.一般资料
1.1.菌株来源 在广州市胸科医院结核病生物样本库中选择异烟肼耐药结核分枝杆菌株236 株、异烟肼敏感结核分枝杆菌株144株。
1.2.试剂与仪器 结核分枝杆菌DNA 提取试剂盒、溶菌酶为上海生物工程公司产品，分枝杆菌Middlebrook 7H10 培养基为美国BD 公司产品，C1000TM Thermal Cycler PCR 扩增仪、DNA 水平电泳仪、Gel DocTM XR+ImagineSystem 凝胶成像仪由美国BIO-RAD 公司生产，Nano Drop one 超微量紫外分光光度计由美国Thermo fisher公司生产。
2.实验方法
2.1.PCR 扩增引物 参考结核分枝杆菌H37Rv 标准株katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因序列，设计5 种基因PCR 扩增引物（表1），引物合成由北京六合华大基因科技有限公司完成。
表1 5种基因PCR扩增引物设计
2.2.结核分枝杆菌复苏培养 在生物样本库中选择目的结核分枝杆菌株，应用Middlebrook 7H10 培养基进行复苏培养，收获对数生长期纯培养物。
2.3.DNA 提取 85 ℃ 45 min 灭活上述检测株纯培养物，按结核分枝杆菌DNA 提取试剂盒说明书进行DNA 提取，并应用Nano Drop one 超微量紫外分光光度计检测DNA提取纯度，符合要求者行PCR扩增。
2.4.PCR 扩增 反应总体积为50 µl：TaKaRa Taq（5 U/µl）0.5 µl、10×PCR Buffer 5 µl、dNTP Mixture 4 µl、DNA模板1 µl、上下游引物各2 µl、灭菌蒸馏水35.5 µl。反应条件：95 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s～1 min，循环30 次；
最后72 ℃延伸7 min。PCR 扩增完成后，取PCR 扩增产物4 µl 在1%琼脂糖凝胶上电泳，应用Gel DocTM XR+ImagineSystem 凝胶成像仪观察结果，检测PCR产物是否合格，合格者进入基因测序环节。
2.5.基因序列测定与分析 基因测序由北京六合华大基因科技有限公司完成，以结核分枝杆菌H37Rv 标准序列为参照，应用DNAMAN、CHORMAS、DNASTAR 等软件分析基因突变结果。
3.统计学方法
应用Microsoft Office Excel 2013 收集相关资料，以katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA、ndh 基因分类和单基因突变、双及多基因突变分别进行行分类，描述性分析各基因突变出现的频率。
1.5 种结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变的总体情况分析（表2）
表2 380株结核分枝杆菌临床分离株异烟肼（INH）耐药的5种基因突变总体情况
在INH 耐药株中发现26 个位点29 种突变类型，在INH敏感株中发现16 个位点17 种突变类型。在katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 中分别发现3 个位点5 种突变、5 个位点5 种突变、11 个位点13 种突变、6 个位点6 种突变和11 个位点11 种突变。基因突变类型以katG 基因315AGC（S）→ACC（T）、mabA-inhA 基因-15T→C 最为常见。
2.结核分枝杆菌基因突变模式分析（表3）
表3 380株结核分枝杆菌临床分离株的INH耐药基因突变类型
在异烟肼耐药结核分枝杆菌菌株中发现20种单基因突变模式株、18种双基因突变模式株，在异烟肼敏感结核分枝杆菌菌株中则见到12种单基因突变模式、1种双基因突变模式、1种3基因突变模式和1种4基因突变模式，也发现3株结核分枝杆菌在同一基因上的两个不同位点存在突变，但双基因以上突变模式发生的频率很小，仅为7.89%（30/380）。
在抗结核治疗中，异烟肼为最有效的早期杀菌活性药物，其进入结核分枝杆菌后由菌体过氧化物-过氧化氢酶将其转化为活性形式，它可与脂酰基载体蛋白M（AcpM）及β-酮脂酰载体蛋白合成酶（KasA）通过共价键形成复合体，抑制结核分枝杆菌分枝菌酸的合成而破坏细菌细胞壁；
而katG 基因突变或缺失、inhA 基因或ahpC 启动子突变导致的基因过表达是结核分枝杆菌对异烟肼产生耐药的主要分子机制［6-7］。不过到目前为止，这些基因突变仍不能全面阐释结核分枝杆菌的异烟肼耐药，更多可能的异烟肼耐药的相关基因将会被不断发现。有研究报道，应用结核分枝杆菌全基因组测序可将异烟肼耐药预测的灵敏度和特异度分别达到97.1%和99.0%［8］。这为我们探寻结核分枝杆菌异烟肼耐药新机制提供了更为有用的分子生物学信息。我们的研究显示：katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 5 个基因的36 个位点呈现出40 种基因突变类型、28 种单基因和21 种双基因以上突变模式（表2、表3），异烟肼耐药株katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC 基因突变的频率分别为52.11%、22.46%和5.93%。Krittanan 等［9］在泰国结核分枝杆菌异烟肼耐药株中发现33 种突变，katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC基因突变的频率分别为84.8%、9.1%和6.1%；
来自蒙古的文献［10］报道katG、mabA-inhA 基因突变的频率分别为28.11%和72.37%；
而吉尔吉斯共和国的研究［11］则显示katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC 基因突变的频率分别为91.2%、7%和1.8%，这些研究结果充分显示结核分枝杆菌异烟肼耐药的相关基因突变具有明显的地域性特点。同时还有研究显示，结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的地域性分子特征也会随时间的推移发生一定的变化，Huo 等［12］报道我国异烟肼耐药结核分枝杆菌katG 基因突变率已由2005 年的76.8%降至2015年的70.5%，mabA-inhA 基因突变率则相应由14.6%升至26.7%，这预示结核分枝杆菌异烟肼耐药的分子机制也具有一定的时序性，如何科学把握结核分枝杆菌异烟肼耐药的时空特征并应用于耐药结核病控制实践，是摆在人们面前的一大课题。
从表2、表3我们还可看到，在144株异烟肼敏感结核分枝杆菌株中，在34 株（23.61%）中检测到基因突变，katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因突变的发生率分别为11.11%、11.11%、4.17%、1.39%和3.47%，如何解释在异烟肼敏感结核分枝杆菌株中竟然有如此高比例的基因突变发生，的确不是一个简单的科学问题。我们认为原因不外以下几个方面：一是耐药表型检测问题，二是耐药异质性问题，三是基因突变的实质性意义问题，四是其他药物耐药的影响问题。耐药表型问题可以通过药物敏感性测试复核予以纠正，耐药异质性问题目前已有文献报道确实存在［13］，也的确有的基因突变为无义突变，如本文表2 的katG 基因295CAG（Q）→CAA（Q），通过仔细的分析发现，结核分枝杆菌其他抗结核药物耐药将对异烟肼耐药相关的基因突变产生重要影响，我们认为需要引起密切关注，也将另文发表相关研究以抛砖引玉。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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