何姬，刘妍如*，段金廒，唐志书,3，宋忠兴，赵艳婷，张德柱，杨国伟
1陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，咸阳 712083；
2南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 江苏省方剂高技术研究重点实验室,南京 210023；
3中国中医科学院，北京 100700；
4陕西盘龙药业集团股份有限公司，商洛 711400；
5山西省检验检测中心(山西省标准计量技术研究院)，太原 030002
盘龙七片来源于中医骨伤世家王家成所献秘方，是由29味中药组成的复方制剂。临床上主要用于治疗风湿类、腰肌劳损、软组织损伤所致的疼痛、肿胀等病症[1,2]。研究表明生物碱是盘龙七片的主要成分之一，通过下调炎症因子，调节巨噬细胞极化等途径发挥抗炎镇痛的作用[3-5]。现代药理学结果显示部分生物碱类既是有效成分也是毒性成分[6]，如使用不当可导致严重的不良反应，而目前盘龙七片的质量控制标准(《国家中成药品标准》WS3-B-3998-98-1)未对生物碱含量进行测定[7]。因此，为了提高盘龙七片的质量控制水平，保证其临床用药的安全性和有效性，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对盘龙七片中具有抗炎镇痛作用的生物碱类成分进行表征，然后建立同时测定其含量的定量方法，为提高盘龙七片质量控制水平提供数据基础。
1.1 仪器
Triple TOFTM5600三重四级杆飞行时间质谱仪(美国爱博才思公司)；
FW-400AD高速万能粉碎机(天津鑫博得仪器有限公司)；
Agilent 1290型高效液相色谱串联AB SCIEX4500 Qtrap三重四级杆线性离子阱质谱仪(美国安捷伦公司，美国爱博才思公司)；
KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
Sartorius CPA225D十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)。
1.2 材料
对照品别隐品碱(批号MUST-22031111，纯度98.12%)；
小檗红碱(批号MUST-21120701，纯度98.71%)；
次乌头碱(批号MUST-22032312，纯度98.59%)；
二氢盐酸白屈菜红碱(批号MUST-22032004，纯度99.21%)；
四氢小檗碱(批号MUST-22030608，纯度99.27%)；
苯甲酰乌头原碱(批号MUST-22042014，纯度98.26%)；
盐酸盐酸白屈菜红碱(批号MUST-21101002，纯度99.41%)；
盐酸小檗碱(批号MUST-22010607，纯度98.38%)；
盐酸盐酸血根碱(批号MUST-21062912，纯度99.76%)；
苯甲酰次乌头原碱(批号MUST-22030911，纯度99.68%)；
苯甲酰新乌头原碱(批号MUST-22031710，纯度98.55%)均购自成都曼斯特生物科技有限公司；
欧乌头碱(批号HR2056W1，纯度≥98%)；
二氢血根碱(批号HR2111W10，纯度≥98%)均购自宝鸡辰光生物科技有限公司；
乌头碱(批号230001-202105，纯度≥98%)；
新乌头碱(批号240007-202104，纯度≥98%)均购自上海鸿永生物科技有限公司 ；
原阿片碱(批号110853-201805，纯度99.6%)购自中国食品药品鉴定研究所；
α-玉柏碱(批号AF21061902，纯度≥98%)购自成都埃法生物科技有限公司；
无水乙醇(分析级，安徽安特食品股份有限公司)；
甲醇(分析级，成都市科隆化学品有限公司)；
乙腈(色谱级，德国默克公司)；
甲酸(批号：H158A，美国西格玛奥德里奇公司)；
水为超纯水(密理博超纯水机制备)。样品为盘龙七片及单味药材，由陕西盘龙药业集团股份有限公司提供(见表1)。
表1 盘龙七片样品及单味药材信息Table 1 Panlongqi tablets samples and single flavor medicinal material information
1.3 溶液的制备
1.3.1 对照品溶液的制备
分别称取对照品适量，加甲醇制成每毫升含苯甲酰次乌头原碱6.00 μg/mL，小檗碱6.00 μg/mL，二氢白屈菜红碱2.90 μg/mL，苯甲酰新乌头原碱9.50 μg/mL，二氢血根碱4.80 μg/mL，欧乌头碱3.33 μg/mL，盐酸血根碱2.80 μg/mL，原阿片碱2.90 μg/mL，苯甲酰乌头原碱8.57 μg/mL，别隐品碱2.40 μg/mL，α-玉柏碱2.70 μg/mL，白屈菜红碱2.90 μg/mL，四氢小檗碱2.60 μg/mL，次乌头碱1.67 μg/mL，乌头碱13.60 μg/mL，新乌头碱3.00 μg/mL，小檗红碱1.53 μg/mL的对照品储备液，于4 ℃保存。分别等量吸取上述对照品储备液混匀并浓缩3倍作为混合标准品溶液，于4 ℃保存。
1.3.2 供试品溶液的制备
取本品20 片除去包衣，研细，混匀，精密称取细粉约0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超声25 min(250 W，40 kHz)，放冷至室温，称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液[7]。
1.3.3 单味药材样品的制备
取伸筋草、铁棒锤、老鼠七、草乌、川乌各0.5 g，精密称定，按“1.3.2”项下方法制备单味药材溶液。
1.3.4 阴性样品的制备
按盘龙七片处方比例及制备工艺分别制备缺伸筋草、缺老鼠七、缺草乌、缺川乌、缺铁棒锤的阴性样品，按照“1.3.2”项下方法制备各阴性样品供试品溶液。
1.4 成分表征条件
1.4.1 色谱条件
采用ACQUITY UPLC®BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱，流动相为0.1%甲酸-水溶液(A)-乙腈溶液(B)，梯度洗脱程序：0～2 min，0.2%→12% B；
2～8 min，12%→13% B；
8～14 min，13%→30% B；
14～24 min，30%→45% B；
24～35 min，45%→70% B；
35～42 min，70%→90% B；
42～46 min，90%→0.2% B；
46～50 min，0.2%→0.2% B；
柱温40 ℃；
体积流量为0.3 mL/min，进样量2 μL。
1.4.2 质谱条件
离子源为电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下，采用信息依赖采集(IDA)、动态背景扣除(DBS)和高灵敏度模式采集数据。离子扫描范围m/z100～2 000，正离子模式下源喷射电压(ion spray voltage floating)为5 500 V，裂解电压(declustering potential，DP)为80 V，碰撞能量(collision energy，CE)为35 V，正离子模式下，雾化气(ion source gas 1，GS1)和辅助气(ion source gas 2，GS2)为氮气，皆为50 psi，气帘气(curtain gas，CUR)为35 psi，雾化温度(temperature，TEM)550 ℃。
1.5 定量条件
1.5.1 液相条件
同“1.4.1”项。
1.5.2 质谱条件
定量质谱分析采用ESI正离子模式进行扫描，检测模式为多反应检测(multiple reaction monitoring,MRM)。离子化参数为离子喷雾电压，正离子模式5 500 V；
雾化气和辅助气为氮气，皆为50 psi；
离子源温度550 ℃。化合物离子对，优化后的采集参数：去簇电压(declustering potential，DP)、碎裂能量(collision energy，CE)和碰撞池出口电压(cell exit potential，CXP)等信息见表2。
表2 盘龙七片中17种生物碱类化合物检测参数Table 2 LC-MS-MS data for the seventeen alkaloids in PLT
续表2(Continued Tab.2)
2.1 成分表征
单味药材、盘龙七片生物碱成分表征正离子模式的总离子流图见图1。通过Peakview 2.2 查看采集数据，以AB SCIEX master view 1.1.0.0 中药成分数据库(TCM library 1.0)作为生物碱成分匹配库。通过比对精确质量数、同位素峰度比以及碎片离子裂解规律等信息，初步从盘龙七片中表征出17种生物碱成分并做了单味药材成分归属(见表3)。
图1 单味药材、盘龙七片生物碱成分表征的正离子模式总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram for the characterization of single herbs and Panlongqi tablets alkaloids composition under positive ion mode 注：A.老鼠七；
B.伸筋草；
C.铁棒锤；
D.草乌；
E.川乌；
F.盘龙七片(批号20210329)；
1～17的化合物名称见表3。Note:A.HR;B.LH;C.APR;D.AKR;E.AR;F.PLT (Batch Number 20210329);The compound names of 1-17 are shown in Table 3.
表3 盘龙七片中17种生物碱成分Table 3 Seventeen alkaloids components in the PLT
2.2 定量方法学考察
根据UPLC-Q-TOF-MS确定的生物碱成分，采用UPLC-ESI-MS/MS对盘龙七片中17种生物碱成分进行定量方法学考察。
2.2.1 专属性
分别取空白、混合对照品溶液、供试品溶液、缺单味药材的阴性供试品溶液，按“1.5”项下条件进样分析，MRM提取离子图见图2。除铁棒锤、草乌、川乌中均含有相似的生物碱成份外，在其他对照品出峰位置上缺单味药材阴性供试品溶液未见干扰峰，说明单味药材中的生物碱成分不干扰盘龙七片中化合物的测定。
图2 空白、混合对照品、供试品溶液、阴性供试品溶液的MRM提取离子图Fig.2 MRM extraction ion chromatograms of blank,mixed control,test solution and negative test solution注：A.空白；
B.17种对照品(名称见表2)；
C.供试品溶液(批号20210329)；
D：缺老鼠七单味药材；
E：缺伸筋草单味药材；
F：缺川乌单味药材；
G：缺铁棒锤单味药材；
H：缺草乌单味药材。Note:A.Blank;B.Seventeen kinds of controls (the names are shown in Table 2);C.Test solution (batch number 20210329);D:Lack of HR;E:Lack of LH;F:Lack of AR;G:Lack of APR;H:Lack of AKR.
2.2.2 标准曲线、检出限和定量限
精密吸取“1.3.1”项下混合对照品溶液，加入甲醇按梯度体积稀释，按照“1.5”项下条件进行测定，记录色谱图。以被测化合物浓度(μg/mL)为横坐标(x)，相应峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。
盘龙七片不同化合物的线性范围为0.26×10-3～28.5 μg/mL，且相关系数均大于0.999，表明各对照品线性关系良好。17种生物碱的线性方程、相关系数、线性范围及定量限、检测限结果见表4。
表4 17种生物碱同时测定方法线性方程、线性范围、定量限、检测限结果Table 4 Linear equations,linear ranges,quantitative limits,and detection limits of seventeen alkaloids simultaneous determination methods
2.2.3 精密度试验
取盘龙七片供试品溶液(批号20210329)，按“1.5”项下色谱条件连续进样6次，计算盘龙七片中17种生物碱峰面积的RSD在2.00%～2.95%之间，表明仪器精密度良好。
2.2.4 稳定性试验
取盘龙七片的供试品溶液(批号20210329)，按“1.5”项下色谱条件分别于制备后0、3、6、9、12、24 h进样，计算盘龙七片中17种生物碱峰面积的RSD在1.18%～4.48%之间，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.5 重复性试验
取盘龙七片(批号20210329)6份，按“1.3.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“1.5”项下色谱条件进样，计算盘龙七片中17种生物碱含量的RSD在0.75%～5.65%之间，表明此方法重复性良好。17种生物碱精密度、稳定性、重复性结果见表5。
表5 17种生物碱同时测定方法精密度、稳定性、重复性结果(n = 6)Table 5 Results of precision,stability and repetitive of seventeen simultaneous determination methods of alkaloids (n = 6)
2.2.6 加样回收率试验
精密称取同一供试品(批号20210329)约0.5 g，共6份，置25 mL具塞锥形瓶中，加入各对照品适量，按“1.3.2”项方法制备供试品溶液，在“1.5”项下的色谱条件下进行测定，记录不同成分相应信号强度，计算加样回收率。各成分的平均回收率和RSD的结果见表6。
表6 17种生物碱同时测定方法平均加样回收率及RSD结果(n = 6)Table 6 Average dosing recovery rate and RSD results of seventeen alkaloids simultaneous determination methods (n = 6)
续表6(Continued Tab.6)
2.2.7 样品测定
按“1.5”项的条件，测定并计算8批盘龙七片中17种生物碱成分的含量(μg/g)，结果见表7。
表7 8个批次盘龙七片中17种生物碱成分的含量Table 7 The content of seventeen alkaloids components in eight batches of PLT(μg/g)
3.1 检测条件及供试品溶液制备方法的选择
综合考虑生物碱类成分的结构和极性特点，采用MRM扫描模式，正、负离子模式分别检测，根据响应值及色谱峰的数量选择正离子模式检测。考察了提取方式(超声、加热回流)、提取溶剂(无水乙醇、70%甲醇、100%甲醇)对盘龙七片生物碱类成分提取的影响，综合色谱峰峰型及响应值，本研究选择甲醇超声提取25 min为盘龙七片中生物碱的提取方法。
3.2 潜在质量控制成分指标筛选
生物碱类成分是盘龙七片发挥抗炎镇痛功效的重要成分之一，其中含量较高的单酯类生物碱苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱由双酯类生物碱乌头碱、新乌头碱、次乌头碱水解得到，在保留其抗炎、抗风湿、治疗关节炎等药理作用的同时毒性大大降低。结合生物碱类指标成分的相关研究[11,15,16]，本文选择苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱作为潜在的质量指标成分。乌头碱类生物碱成分水解方式如图所示[17]，如图3。
图3 乌头碱类生物碱成分水解过程Fig.3 Hydrolysis process of aconitine alkaloid components
3.3 异喹啉生物碱成分含量差异
通过比较8个批次样品中异喹啉生物碱的成分含量差异，发现盐酸血根碱、二氢血根碱、盐酸白屈菜红碱、二氢盐酸白屈菜红碱、别隐品碱、小檗红碱、四氢小檗碱、原阿片碱各批次含量较为稳定，而盐酸小檗碱各批次含量差异较大。分析原因可能是小檗碱为季胺碱，在游离状态对热不稳定分解成为小檗红碱，与盘龙七片中的黄酮类等酸性成分结合生成盐，造成盐酸小檗碱含量的变化[18,19]。
盘龙七片是临床中治疗风湿骨痛类疾病的重要药物，由于其含有毒性生物碱类成分，药物的安全性更应得到重视。故基于UPLC-Q-TOF-MS技术表征出的盘龙七片中17种生物碱成分，本文建立了盘龙七片中生物碱类成分同时测定的液质联用方法，所建方法准确可靠，可为提升盘龙七片的质量控制水平提供基础。
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